JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengineering

ננוליתוגרפיה בדיקה סריקת שטח גדול בהנחייתם של יישור אוטומטי ויישומו המצע פבריקציה נוספת ללימודי תרבות תא

Published: June 12, 2018
doi:
10.3791/56967
, , , , , ,
1Manchester Institute of Biotechnology & School of Chemistry,University of Manchester, 2School of Engineering,University of Liverpool, 3School of Electrical and Electronic Engineering,University of Manchester, 4School of Science and Technology,Nottingham Trent University

Summary

כאן אנו מציגים עבור סריקה מרחבית ננוליתוגרפיה בדיקה זמינה על-ידי יישור איטרטיביים של מערכי בדיקה, כמו גם הניצול של דפוסי ליטוגרפית ללימודי אינטראקציה תא-פני פרוטוקול.

Abstract

סריקת בדיקה מיקרוסקופיית אפשרה היצירה של מגוון שיטות בונה (”) מלמעלה למטה מימדיות של תכונות בקנה מידה ננומטר. מבחינה היסטורית, חיסרון גדול של סריקת בדיקה ליתוגרפיה כבר התפוקה נמוכה ממהותם של מערכות בדיקה בודדת. זה יש כבר הסתער על ידי השימוש של מערכים של הגששים מרובים כדי לאפשר ננוליתוגרפיה מוגברת תפוקה. לצורך יישום כזה ננוליתוגרפיה ויישומי, יישור מדויק של מערכי בדיקה עם משטח המצע הוא חיוני, כך לבצע רגשים כל קשר עם פני השטח בו זמנית כאשר המתבנת ליטוגרפיה מתחילה. פרוטוקול זה מתאר את הניצול של פולימר ליתוגרפיה עט כדי לייצר ננומטר-סולם תכונות מעל אזורים בגודל סנטימטר, בהנחייתם של השימוש של אלגוריתם עבור יישור מערכי בדיקה מהירה, מדויקת, אוטומטית. . הנה, ננוליתוגרפיה של תיולים על מצעים זהב מדגים את הדור של תכונות עם אחידות גבוהה. הדפוסים הללו הם functionalized ואז עם fibronectin לשימוש בהקשר של תא שטח מכוון מורפולוגיה מחקרים.

Introduction

התקדמות בננוטכנולוגיה היא תלויה התפתחות טכניקות מסוגל ביעילות ובאמינות בדיית תכונות ננו על משטחים. 1 , עם זאת, 2 יוצר כזה כולל על פני שטחים גדולים (מספר ס מ2) באופן אמין, על עלות נמוכה יחסית היא מאמץ לא טריוויאלי. רוב טכניקות הקיים, נגזר תעשיית המוליכים למחצה, מסתמכים על פוטוליתוגרפיה פולשני ליצור חומרים ‘קשים’. לאחרונה, שיטות ליטוגרפיה נגזר סריקת בדיקה מיקרוסקופית (SPM) הופיעו כמו בגישה נוחה, רב-תכליתי עבור שטנץ מהירה של ננו עיצובים. 3 טכניקות מבוססות SPM מסוגלים במהירות ובנוחות ‘ לכתוב ‘ בכל תבנית על-ידי המשתמש. הידועה ביותר של אלה הוא מח שעט ננוליתוגרפיה (DPN), חלוץ ידי מירקין. et al.,4 שם בדיקה סריקה משמש בתור ‘עט’ להעביר ‘דיו’ מולקולרית השטח בהפקת תכונות בצורה מקבילה לכתיבה. תחת תנאי הסביבה, כמו בדיקה נסרק על פני משטח מולקולות ‘דיו’ מועברים על פני השטח באמצעות מניסקוס מים צורות בין החללית לבין פני השטח (איור 1). DPN ובכך מאפשר בתצהיר nanolithographic של מגוון רחב של חומרים, כולל חומרים “רכים” כגון פולימרים מולקולות. 5 באמצעות הגששים מהונדסים עם ערוצים עבור משלוח נוזל, טכניקות הקשורות בדרכים שונות המכונה ‘nanopipettes’, ‘ננו-מזרקה עטים’, גם דווחו. 6 , 7 , 8

המכשול העיקרי ליישום רחב יותר של ליתוגרפיה SPM-derived היא תפוקת, כפי שהוא דורש תקופה ארוכה מדי דפוס סנטימטר בקנה מידה אזורי גשש בודד. המאמצים המוקדמים כדי לטפל בבעיה זו התמקדו parallelization של DPN המבוסס על זיז, עם ‘אחד-מימדי’ וגם ‘דו מימדי’ מערכי בדיקה (2D) שדווח עבור ליתוגרפיה של אזורים בגודל סנטימטר. 5 , 9 . אולם, אלה זיז מיוצרים באמצעות שיטות ייצור שקודמים מורכבות יחסית ומעריכי חלשים יחסית. ההמצאה של פולימר עט ליתוגרפיה (PPL) התייחס בעיה זו על-ידי החלפת cantilevers SPM סטנדרטי של מערך דו-ממדי של הגששים elastomer siloxane רך בונדד לשקופית זכוכית. 10 תוכנית התקנה זו בדיקה פשוטה מקטין באופן משמעותי את העלות והמורכבות של תכנים שטחים גדולים, פתיחת ננוליתוגרפיה למגוון רחב של יישומים. ארכיטקטורה זו ללא זיז הורחב גם כדי קשה-טיפ קפיצים רכים לליטוגרפיה,11 אשר מספק הכלאה של גיבוי אלסטומרים רכים עם טיפים סיליקון קשיח נותנת רזולוציה משופרת לעומת דפוסים המיוצר באמצעות רך אלסטומר טיפים.

גורם מכריע בביצוע של טכנולוגיות אלה דו-ממדיות מערך הוא המערך בדיקה חייב להיות מקביל בדיוק המצע משטח כך כשהוא מנוצל ליתוגרפיה, כל הגששים לבוא במגע עם המשטח בו זמנית. אפילו אי-התאמות קטן יכול לגרום הבדל משמעותי בגודל תכונה מצד אחד של המערך השני, מאז הגששים כמה יבואו במגע עם המשטח מוקדם יותר במהלך הירידה של המערך, בעוד אחרים יבואו במגע מאוחר או בכלל לא. 12 יישור מדויק חשוב במיוחד עם PPL בשל ודפורמביליות של הגששים elastomer רך, איפה הגששים פנייה אל פני השטח קודם לכן יהיה דחוס, להשאיר טביעת רגל גדולה יותר על פני השטח.

העבודה מוקדם על PPL מועסקים בדיקה ויזואלית בלבד כדי להנחות תהליך יישור, בעזרת מצלמה רכוב מעל המערך להתבונן להרכב של הגששים כפירמידה כפי הם הובאו במגע עם המשטח. 10 יישור נשפט על ידי התבוננות באיזה צד של הגששים בא במגע עם המשטח תחילה, ולאחר מכן התאמת הזווית חוזר את ההליך בצורה איטרטיבית עד ההבדל בין קשר בכל צד של המכשיר היה שהכחיש העין. כפי בהליך יישור זה מסתמך על בדיקה ויזואלית סובייקטיבית על ידי המפעיל, הפארמצבטית הוא נמוך.

לאחר מכן, בגישה אובייקטיבית יותר פותחה, המורכב חיישן כוח רכוב מתחת המצע למדוד לחיל. מוחל על מגע של הגששים על פני השטח. 12 יישור ובכך הושג על-ידי התאמת הזוויות הטיה להגדיל את הכוח שהופעל, אשר ציין כי כל הגששים היו בו זמנית במגע. שיטה זו הראה כי יישור כדי בתוך 0.004° המקבילה משטח אפשרי. זה ‘חיל משוב מכונות להשמה והפצה’ עכשיו יושם לתוך מערכות אוטומטית לחלוטין שני דוחות עצמאיים. 13 , 14 שני להשתמש שילוש של חיישנים חיל רכוב או המצע מתחת או מעל המערך, למדוד את כמות הכוח המופעל על קשר בין מערכי בדיקה פני השטח. מערכות אלה לתת ברמת דיוק גבוהה, דיווח misalignments של ≤0.001 מעלות מעל 1 ס מ אורך קנה מידה,14 או ≤ 0.0003 ° מעל 1.4 ס מ.13 מערכות אוטומטיות יישור אלה מספקים גם רס ן תוך חיסכון למפעיל זמן וזמן הכללית כדי להשלים ליתוגרפיה תהליך.

יישום מרכזי אחד של תפוקה גבוהה משטח פבריקציה נוספת זמינה על-ידי טכנולוגיה זו הוא הדור של סובסטרטים התרבות תאים. ובכן עכשיו שמאץ פנוטיפ תא הזה ניתן לטפל על ידי שליטה האינטראקציה הראשונית בין תאים לבין תכונות פני השטח, וזה יכול להיות מוגברת זו-ננו. 15 . במיוחד, שיטות סריקה של ליתוגרפיה בדיקה הוכחו להיות שיטה נתיישב לייצר מגוון רחב של משטחים nanofabricated כזה ניסויים התרבות התא. 16 . לדוגמה, משטחים מציג דפוסי ננו monolayers עצמית שהורכבו ו מטריצה חוץ-תאית חלבונים בתבניות על ידי PPL DPN שימשו כדי ללמוד את הפוטנציאל של חומרים ננו-השתנה בחומר המושרה הבידול של תאי גזע. 17

פרוטוקול זה מתאר הניצול של כוח אטומי שונה מיקרוסקופ (AFM) מערכת המאפשרת PPL שטח גדול. פירוט לנו האיתור של כוח באמצעות חיישנים כוח מרובים כאמצעי לקביעת בדיקה-משטח מגע, יחד עם אלגוריתם אשר הופך לאוטומטי את תהליך איטרטיבי יישור. Functionalization הבאים מדפוסים אלה עם fibronectin חלבון מטריצה חוץ-תאית, התרבות של האדם גזע mesenchymal (hMSC) מתוארים, כמו הפגנה של משטחים מפוברק-PPL בקשה לקבלת תרבית תאים.

Protocol

1. ייצור המערך עט PPL כדי להכין לתערובת קופולימר polydimethylsiloxane (PDMS): להוסיף 10 µL של פלטינה (0) – 1, 3 – divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane פתרון מורכב ו- 172 µL של 1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane כדי 250 גר’ (7-8% w/w vinylmethylsiloxane)-פולימר שיתוף dimethylsiloxane. מערבבים רכיבים אלה ביסודיות על מערבל רוטרי במשך 7 ימים להבטיח ערבוב הומוגנית.התראה: פלטינה (0) – 1, 3 – divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane הוא רעיל. אנא קרא MSDS לפני עבודה עם הפתרון הזה. ציוד בטיחות חובה לחבוש בזמן הטיפול הכימי. להוסיף 0.5 גר’ (25-35% w/w methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane פולימר שותף לחלק 1.7 g של תערובת מהשלב 1.1.1 תוך שקילה סירה ומערבבים היטב עם מרית. דגה תערובת זו על ידי העברת אותו desiccator ואקום וחושף את התערובת לחץ נמוך (200 mTorr, 0.3 mBar) במשך 20 דקות עד כל הבועות הגז מתפזר. מקום 13 פרק 13 מ מ זכוכית שקופית בבקבוקון פלסטיק מצופה בורג מלא עם 20 מ ל 2-פרופנול, מקום ואז את המבחנה באמבט אולטרא 10 דקות להסיר את כל פסולת גדולה. לשטוף את השקופיות על-ידי השוקע בשקופיות 2 טריים-פרופנול (100 מ”ל) ויבש תחת זרם של גז חנקן. המקום סיליקון מאסטר18 לתוך צלחת פטרי בקוטר 4 ס מ ומוסיפים מספיק degassed תערובת prepolymer PDMS (מתוך שלב 1.1) עד כיסוי מלא. בדרך כלל, 100 µL נדרש עבור מאסטר 20 x 20 מ מ. מקום האדון עם התערובת prepolymer dessicator ואקום. דגה הפולימר עבור נוספת 5 דקות כדי להסיר את כל הבועות גז שנוצר במהלך ההעברה של התערובת. הטיפול פלזמה2 O של השקופיות זכוכית (שלב 1.4 להלן) צריכה להתבצע בזמן degassing הוא מתרחש. לפנק את הריבועים זכוכית עם פלזמה2 O (600 mTorr) ב RF כוח מרבי עבור 1 דקות כדי להסיר את כל זיהום אורגני וכדי ליצור שכבה אחידה תחמוצת על הזכוכית עבור אדהזיה elastomer. 19 שימוש הפלזמה מטופלים שקופיות מיד בשלב הבא. בזהירות המקום השקופית זכוכית מרובע (מתוך שלב 1.4) מעל prepolymer הבסיס (מתוך שלב 1.3) עם הצד ניקיתי פלזמה פונה כלפי מטה. לחץ בעדינות במורד השקופית זכוכית על גבי הבסיס סיליקון כדי להסיר את כל האוויר לכודה ולהבטיח שסרטו האחיד של PDMS דחוקה בין הבסיס לשקופית. מקום המערך PDMS sandwiched מעל שלב בצלוחית עם הסיליקון לשלוט בחלק התחתון (קרי, עם הגב של השקופית זכוכית כלפי מעלה) ומניחים את המנה בתנור-70−80 ° C עבור 24−48 h כדי תרמית לרפא את PDMS. להסיר את המערך נרפא מן התנור, לאפשר להתקרר למשך 15 דקות, ואז עם סכין גילוח בזהירות להסיר את כל PDMS עודף מאחור, צידי הזכוכית שקופית והשתמש זרם של חנקן יבש לפוצץ נפולת PDMS חופשי.הערה: לטפל לא כדי לגרד המאסטר סיליקון עם הלהב גילוח, כמו זה עלול לגרום נזק את ציפוי טפלון. וודג סכין גילוח לפינה של המערך בעומק של 1 מ”מ, הוצא בזהירות את המערך מלבד המאסטר. בצע פעולה זו בפעולה הרמה רציפה בודדת; אל תאפשר את מערכי להסתמך על גבי הבסיס. בזהירות לחתוך ו לגרד משם 0.5 מ מ של PDMS בקצוות של המערך עם סכין גילוח. השתמש זרם של חנקן יבש לפוצץ נפולת PDMS חופשי.הערה: זה עשוי להיות קל יותר לבצע שלב זה זמירה תחת סטריאוסקופ או זכוכית מגדלת. . שמור על עצמך לא לגרד המאסטר סיליקון עם הלהב גילוח, כמו זה עלול לגרום נזק את ציפוי טפלון. 2. מערך הכנה מכשירי הרכבה סובסטרט יצירת משטח הידרופילית במערך בדיקה על-ידי טיפול פלזמה2 O: מקם את המערך עט PPL בצלחת פטרי לתא פלסמה ולאחר מכן להחיל ואקום 600 mTorr. . הפעילי את הגנרטור פלזמה (בהגדרה המרבית) ב-30 s. לשחרר את הואקום, להסיר את המערך ולבדוק hydrophilicity שלה על ידי שחרור 20 µL של מים יונים על המערך והתבוננות יש אפילו הפצת המים על פני השטח. אם זה לא התרחשה, נושא את המערך סיבוב שני של טיפול פלזמה. לאחר מכן, יבש המערך ביסודיות עם זרם של גז חנקן יבש. באמצעות הקלטת פחמן דו-צידית, לצרף את המערך אל האמצע של בעל המכשיר. הר בעל המכשיר על גבי המחזיק קנטית AFM (איור 2). כדי לטעון את המערך PPL בחומצה 16-mercaptohexadecanoic (מנהל) (‘סימון בדיו’): להכין 1 מ מ 16-mercaptohexadecanoic תמיסה חומצית (מנהל) על ידי המסת 8.6 מ ג 30 מ”ל אתנול צינור והצבתו באמבט אולטראסוני 10 דקות לפזר באופן מלא את המתחם.התראה: 16-mercaptohexadecanoic חומצה הוא רעיל. אנא קרא MSDS לפני עבודה עם הפתרון הזה. ציוד בטיחות חובה לחבוש בזמן הטיפול הכימי. שימוש של micropipette, הפקדה 20 ירידה µL של הפתרון מנהל המערך. יש להימנע ממגע טיפים פיפטה עם המערכים. לאפשר את הפזורים המערך, ולאחר מכן לאפשר האתנול מתמוססות בתנאי הסביבה.הערה: המערך PPL יכולים לחלופין להיות בדיו לאחר היישור התרחש. 10 ברגע הפתרון מנהל התייבש, הר בעל המכשיר עם המערך PPL אל AFM. 3. הכנה של סובסטרטים זהב PPL. מצעים זהב יכול לרכוש, או עשה בתוך הבית על ידי תרמית או אלקטרון לשגר התצהיר, בנויים על שכבה 2 של אדהזיה טיטניום nm ואחריו 20 nm של זהב על רקיק זכוכית או סיליקון. 18 במידת הצורך, לנקות את מצעים על ידי טיפול פלזמה חמצן באמצעות שאר הפרמטרים המתוארים שלב 1.4. מקם את המצע זהב באמצע השלב מדגם AFM ולאבטח עם דבק סביב גבולות המצע (איור 2). התאם את הבמה כדי בגובה הנכון כפי שמצוין בהוראות ההפעלה של היצרן השימוש את z-ציר בקר. 4. יישור אוטומטי מערך עט לפתוח ולהפעיל הבקר הבמה תוכנית ההתקנה (SetupNSF.exe) במחשב כדי לאפס (‘אפס’) צירים כל, זוויות מראש מכוילת נקודת האפס, ולאחר מכן להשתמש בשלב ה- x/y-ציר בקר מסוף כדי לעבור את המצע היישור הרצוי / מיקום ההדפסה. לקבלת תוצאות מיטביות, המצע צריך להיות ממוקם סמוך למרכז הבמה, בין חיישנים כוח של הבמה.הערה: בתוך כמה מודלים של המחשב, ה- x/y-ציר בקר USB אות עלולים להפריע זה מ- z-ציר בקר. אם הדבר יתרחש, נתק את ה- x/y-ציר בקר USB כבל לאחר שלב זה. זה צריך ואז להתחבר לאחר ההליך יישור (שלב 4.7). להחליף את ידית השחרור הבמה כדי לשחרר את הבמה מדגם ולהפעיל השילוש של כוח חיישנים כמצוין על-ידי הוראות היצרן AFM. לאפשר את החיישנים כוח equilibrate למשך 15 דקות לפחות. לקבלת תוצאות מיטביות, לאפשר 30-50 דקות. להגדיל את גובה ציר z כדי להביא את המערך לתוך קרבה עם המצע על ידי התבוננות באופן חזותי את מערך בדיקה, משטח.הערה: קרוב יותר המערך הוא על פני השטח, פחות איטראציות הנדרשים עבור תהליך יישור, ובכך לחסוך זמן. פתח/הפעל התוכנית יישור אוטומטי (יישור אוטומטי v16.exe), הזנת פרמטרים רלוונטיים יישור לתוכנית. הזן את ערך הפרמטר הרצוי ‘זווית צעד”, בדרך כלל-0.15°. הפרמטר זה הזווית היסט לפי הזווית של האופטימלית’ עבור כל ציר הנקבע על-ידי התוכנית. הגדר פרמטר זה בין 0.1 ל- 0.2°, כמו זוויות נמוך יותר טווח זה התוצאה אינה הבדל בכוח לזיהוי בבירור על הגישה של הגששים על פני השטח.הערה: התוכנה מקבל ערכים ב millidegrees (קרי, עונה 1 פרק 10-3 °). לדוגמה, עבור-0.15°, המשתמשים צריכים קלט ‘150.’ הזנת השלב הרצוי גס ‘ ערך פרמטר, בדרך כלל 0.6 מיקרומטר. פרמטר זה הוא גודל צעד ציר z המשמש את הבמה כשהוא מתקרב את הגששים ביישור קשה הראשונית. הגדר פרמטר זה בין 0.2 ו- 1 מיקרומטר. גדול יותר צעד גדלים להקטין משך הזמן עבור תהליך יישור אבל להפחית את הדיוק של היישור, תגביר את-הגששים.הערה: התוכנה מקבל ערכים של השלבים גס מיקרומטר. לדוגמה, עבור מיקרומטר 0.6 המשתמשים צריכים קלט ‘0.6’. הזן את ערך הפרמטר הרצוי ‘שלב בסדר’, בדרך כלל 0.2 µm. הפרמטר זה הגודל שלב ציר z המשמש עבור התאמת משובח של האופטימלית יישור. עבור מרבית היישומים, הגדר פרמטר זה בין 0.1, 0.4 מיקרומטר. המידות הגדולות יותר ערך שלב להקטין את כמות הזמן ליטול את הטבלייה במשך תהליך יישור אלא להפחית את האיכות של היישור.הערה: התוכנה מקבל ערכים של השלבים בסדר מיקרומטר. לדוגמה, עבור 0.2 µm, המשתמשים צריכים קלט ‘0.2.’ להגדיר את נתיב קובץ Excel’ ולצרף עותק יאומתו של קובץ התבנית שסופק גיליון אלקטרוני באמצעות הסמל ‘תיקייה’, ניווט אל מיקום הקובץ ולאחר לחיצה על ‘אישור’. קובץ זה מכיל את הנתונים raw, מחושב המשמש כדי לקבוע הזוויות הטיה הבמה האופטימלי של הבמה. פתח/הפעל תוכנת שליטה AFM. נווט לרכיב ספקטרוסקופיה של תוכנית זו על-ידי לחיצה על לחצן ‘ספקטרוסקופיה’ (בהתאם להוראות היצרן), וקבעו AFM סריקת הראש ציר z כדי נעים על ידי 10 מיקרומטר למעלה מ-100 מילישניות, עם זמן השהיה של 250 ms, ואז לחזור בו 10 מיקרומטר למעלה מ-100 מילישניות עם זמן השהיה של ms 250 (איור 3). כמו AFM נדנוד הראש, לחץ על לחצן ‘התחל’ של התוכנה היישור כדי להתחיל בתהליך יישור אוטומטי. כאשר התוכנית פועלת, התוכנה היא כתיבה וקריאה הנתונים שבקובץ שמתואר בשלב 4.4.4.הערה: היישור לוקח בין 30 דקות ל- 3 שעות בהתאם לתנוחה בשלב ההתחלתי השוכן צעד 4.3 ותצורת התוכנה העשרוני שהוזן בשלב 4.4.התראה: שלב בקר הקונסולות הם עדיין פעיל במהלך תהליך יישור – לא להשתמש בהם במשך תהליך יישור כפי שהדבר יפריע היישור. כשהטיפול היישור, יהיו מוארים תיבת אור ירוק ‘יישור שהושלמו’ על התוכנה יישור (מתוך שלב 4.4). כאשר זה קורה, לחץ על הלחצן ‘עצור’ בממשק המשתמש כדי לסיים את תהליך היישור. לבדוק את הגרפים בקובץ תבנית גיליון אלקטרוני עבור מתאם בין נקודות נתונים מוקלטות הקו מתאים שנוצר על ידי התוכנה. ראה תוצאות נציג דוגמאות התאמה טובה, עם ערכי2 R טיפוסית > 0.99. אם יישור אינה מצליחה, להחליף את מערך בדיקה עם מערך החדש מוכן (שלב 2) וחזור על היישור (שלב 4.4). מזיז את הבמה כלפי מעלה z-ציר באמצעות מסוף בקר הבמה עבור ציר זה. הבמה צריך לעבור במרווחים של 500 ננומטר עד מגע יכול להיות שנצפו מהמצלמה מבט מלמעלה של AFM. הקשר בין מערך המצע יכול להיות שנצפו כמו ‘נקודה לבנה’ של ‘ חדות גבוהה ‘ על השיא של הפירמידות בדיקה בודדים. בשלב זה, לחץ על הלחצן ‘עצור’ על תוכנת שליטה AFM כדי לעצור את התוכנית ספקטרוסקופיה מהשלב 4.5. זה יהיה לסגת את המערך על-ידי 10 מיקרומטר, לכן להשאיר 10 מיקרומטר של הארכה אפשרית ציר z. בדוק את התמונה מהמצלמה מבט מלמעלה של AFM כדי להבטיח כי הגששים אינם בקשר עם המצע. 5. פולימר עט ליתוגרפיה (PPL) נווט לרכיב ליתוגרפיה של תוכנת שליטה על-ידי לחיצה על לחצן ‘הדפס אבן’ על תוכנת שליטה. לבחור את z-אפנון במצב הפעלה ו ייבוא של סריקה (מפת סיביות) או וקטור תמונה אשר ישמש את התבנית ליתוגרפיה. על מנת ליצור את התכונות המוצגות בתוצאות נציג, השתמש במפת סיביות המכיל 20 x 20 שחור פיקסלים (ראה חומר משלים), המייצגים ליתוגרפיה של רשת של 20 x 20 נקודות בדיקה על המערך PPL. הזן את הפרמטרים ליתוגרפיה לתוך חלון ‘ייבוא גרפיקה פיקסל’ של התוכנה בקר AFM. הגדר את ‘גודל’ של התבנית שיווצר, למשל, 40 µm אורך ורוחב. פרמטרים אלה מציינים את רוחב ואורך שבו ייקבע קנה המידה של תמונת מפת הסיביות. כדי ליצור תכונות המוצג בתוצאות נציג, להשתמש רוחב ואורך של 40 µm בשתי מידות. הגדר את ‘מקור’ של התבנית שיווצר-מיקרומטר 25 על ציר x ו- y . פרמטרים אלה לקבוע את מרכז התמונה יחסית למרכז של AFM x/y-צירים. הגדר פרמטרים אלה כדי למנוע את האזור של פני השטח שבו הגששים היו במגע במהלך תהליך היישור. הגדר את הדפסת ‘פרמטרים’. ערכים אלה קובעים הגששים כדי להאריך (כלומר הביא במגע עם המשטח) בתגובה לכל פיקסל בתמונת bitmap. בחר מתוך התפריט הנפתח ‘אפנון Abs Z Pos’ ו- ‘פשט כדי’ שתי שכבות. במצב זה מורה AFM כדי להרחיב את הגששים על ידי מרחק מוחלט שנקבע על ידי רק שתי תוצאות, או ‘שחור (0)’ או השדות ‘לבן (1)’. הגדר את ערכי ‘השחור (0)’, ‘לבן (1)’ שדות 5 ו-5 מיקרומטר, בהתאמה. ערכים אלה קובעים את המרחק הגששים להעבירו בתגובה פיקסל שחור או לבן על תמונת bitmap והם בדרך כלל קבוע בין 3 ל 5 מיקרומטר עבור “בלק” (קרי, להרחיב את הגששים כלפי מטה על ידי המרחק הזה ביחס לנקודת האפס של ציר זה) -3 מיקרומטר-5 עבור ‘לבן’ (קרי, למשוך את הגששים כלפי מעלה על-ידי 3 עד 5 מיקרומטר ביחס לנקודת האפס).הערה: המרחקים נציג האלה מניחים כי סיומת 5 מיקרומטר יוצרת הגששים לבוא במגע עם המשטח, ולכן הדור של תכונה, תוך נסיגה 5 מיקרומטר מרימה את הגששים מהמשטח וכתוצאה מכך אין קשר. Z-סיומת משפיעה על גודל על-ידי קביעת היקף בדיקה קשר עם התוצאה השטח, ככל הרחבות ב- הגששים להיות לחוץ נוספת לתוך השטח, וכתוצאה מכך גדול יותר תכונות. 10 לחץ על לחצן ‘אישור’ כדי ליישם את הגדרות אלה ולסגור את החלון. הכנס הפעם’ השהה’ בחלון ליתוגרפיה של תוכנת שליטה AFM, בדרך כלל 1 s. הגדרה זו קובעת את משך הזמן שהגששים להישאר במצב “בלק” הארכה, אשר מוגדרת בדרך כלל בין s 0.1 ו- 10.הערה: זמן השהיה פעמים לגרום בגדלים תכונה גדול יותר עקב כמות מנהל מועבר אל משטח זהב גדול. ניתן למצוא פרטים נוספים על בקרה על גודלו של תכונות שנוצר בדוחות אחרים. 20 להכין את המתחם שליטה אטמוספרי. הנמך את האטמוספירה בידוד קאמרית על גבי AFM, פתח/הפעל התוכנה שסופק על-ידי יצרן הבקרה אטמוספרי (MHG_control.exe). הגדר תוכנת שליטה האטמוספירה כדי לשמור על לחות יחסית של 45% בטמפרטורה של 25 º C, חילופי אווירה ‘קצב זרימה’ של 500 מ”ל על-ידי הזנת ערכים אלה לתוך התוכנה. לחץ על ‘שימוש’ כדי ליישם את ההגדרות. רכיב הבקרה אטמוספרי תתחיל לשאוב אוויר humidified לתוך החדר.הערה: רמות הלחות גבוה יותר לגרום בגדלים תכונה גדולה יותר בשל היווצרות של מניסקוס מים גדול שנוצר בין מערכים עט השטח. 21 ערך זה מוגדר בדרך כלל בין 40 ל- 60%. קצב הזרימה מוגדרת בדרך כלל בין 300 ו- 500 מ”ל. זורם יותר לאפשר את רמת הלחות הרצויה להגיע במהירות רבה יותר אך פחות מדויק. התוצאות נציג להשתמש קצב זרימה של 500 מ”ל לדור הראשונית של לחות, הוא ירד עד 300 מ”ל בהגיעם הלחות הרצויה, כדי לשמור על רמת מדוייקת ויציבה במהלך ליתוגרפיה. ברגע הלחות הרצויה מתקבל, להתחיל את הרצף ליטוגרפיה על ידי לחיצה על לחצן ‘התחל’ על ממשק התוכנה. עם סיום ליתוגרפיה, להשתמש במסוף בקר הבמה ציר z כדי להעביר את המצע מן המערך על-ידי מפסק הבמה באמצעות מיקרומטר 500. ואז להסיר תא בידוד אטמוספרי הר שלה. להחליף את ידית השחרור הבמה כדי לנעול את הבמה מדגם ולבטל את החיישנים כוח, כמצוין על-ידי הוראות היצרן AFM, ולאחר מכן הסר את המצע מן הבמה. 6. תבנית ויזואליזציה דפוסי ניתן לאבחן באמצעות אחת מהשיטות הבאות, לרוחב כוח סריקה איכול בדיקה מיקרוסקופית או כימית. סריקת פני השטח בדוגמת ב AFM עם מצב כוח לרוחב באמצעות מצב קשר זיז לבחון את התכונות nondestructively.הערה: מיקרוסקופ כוח צדדי יכול לשמש כשיטה לא הורסות של הצגת התכונות המיוצר על ידי פולימר ליתוגרפיה עט; עם זאת, באמצעות שיטה זו, רק שטח קטן יחסית ניתן מטמיעים (בדרך כלל 100 100x מיקרומטר). מאז מנהל הפקיד יכול לשמש להתנגד איכול, צריבה כימי יכול לשמש כדי להסיר את הזהב מן האזורים שאינם בדוגמת. ואז, ניתן לאבחן את האזורים unetched שנוצר על ידי מיקרוסקופ אופטי, כלומר שאזור נרחב ניתן להציג בו-זמנית. 18הערה: מצעים זה הם חרוט בדרך זו לא יכול לשמש לאחר מכן עבור התרבות תא עוקבות הניסויים המתוארים להלן. להכין בנפרד, פתרונות מימית thiourea 40 מ מ, 27 מ מ iron(III) חנקתי, חומצה הידרוכלורית 100 מ מ. הכן את etchant על ידי ערבוב 5 מ של כל אלה שלושה פתרונות. טרי לערבב לפני כל שימוש. 22התראה: thiourea, iron(III) חנקתי, חומצה הידרוכלורית רעילים. אנא קרא MSDS לפני עבודה עם הפתרון הזה. ציוד בטיחות חובה לחבוש בזמן הטיפול הכימי. להעביר את המצע בדוגמת לתוך צלחת פטרי פיפטה מספיק etchant פתרון לתוך המנה כדי לכסות את פני השטח של המצע (בדרך כלל 10 מ ל). לשמור את המצע מתחת למים למשך 4-5 דקות לחרוט 15 ננומטר זהב (בשיעור מקורב של nm 3/min). השלמת לתחריט, להסיר את המצע, לשטוף ביסודיות עם מים ויבשה עם זרם של חנקן.הערה: השלמתו של התחריט נקבעת לפי העובי של משטח זהב שהושג (שלב 3.1) המשויך הקצב איכול שצוין (שלב 6.2.2). בדוק את התכונות זהב חרוט תחת מיקרוסקופ אופטי שדה בהיר. התכונות זהב הנותרות שנשארות אמור להופיע המתאים לתבנית היה מודפס (מתוך שלב 5.2). אם השטח כולו מופיע הומוגנית, מציין כי נשאר כמות משמעותית של זהב, הצעד איכול (בשלב הבא 6.2.2) יש לחזור על 1-2 דקות. 7. דפוס functionalization עם fibronectin לטבול את מצעים בדוגמת לתוך פתרון של 1 מ מ (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) פתרון אתנול עבור 1 ח’ לשטוף המצע שלוש פעמים עם אתנול ויבש ביסודיות תחת זרם של חנקן. שלב זה passivates האזורים זהב בסך.התראה: (11-mercaptoundecyl) hexa(ethylene glycol) הוא רעיל. אנא קרא MSDS לפני עבודה עם הפתרון הזה. ציוד בטיחות חובה לחבוש בזמן הטיפול הכימי. להטביע את מצעים בשנת 10 מ מ תמיסה מימית של2 Co (3) במשך 5 דקות. בשלב הבא, הסר את סובסטרטים הפתרון, שלוש פעמים עם מים הנדסה גנטית, ומייבשים תחת זרם של חנקן יבש.התראה: Co (3)2 הוא רעיל. אנא קרא MSDS לפני עבודה עם הפתרון הזה. ציוד בטיחות חובה לחבוש בזמן הטיפול הכימי. לטבול את המצע בריכוז 50 µg/mL של fibronectin בתוך תמיסת מלח פוספט buffered (PBS), דגירה ב 4 ° C עבור ה 16 לשטוף המצע שלוש פעמים עם PBS, לאחר מכן לייבש את המצע תחת זרם של חנקן יבש.הערה: Fibronectin מאוגדת לאזורים functionalized-מנהל דרך קלאציה של Co(II) על ידי הקבוצות מסוף חומצה קרבוקסילית על מנהל. Fibronectin ואז נקשר Co(II) דרך המחשבים מחייב קולגן. 23 אם רצונך בכך, להמחיש את השטח מכורך fibronectin מאת labelling זה עם נוגדנים פלורסנט: להחיל פתרון 2 מ”ל של בטחונות ארנב unconjugated anti-fibronectin נוגדן ראשוני 5% (w/v) של שור אלבומין (BSA) ב- PBS השטח דגירה ב 4 ° C עבור 16 ה’ לשאוב תגובת שיקוע, לשטוף שלוש פעמים עם PBS. להטביע את המצע בפתרון 2 מ”ל של fluorescently מצומדת ארנב אנטי משני נוגדנים (על דילול המצוין של היצרן, 2 טיפות/mL) 5% (w/v) של BSA ב- PBS, לכסות בנייר, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 1 ה’ לשאוב תגובת שיקוע, שטיפת שלוש פעמים עם PBS. תמונות מיקרוסקופ epifluorescence של התכונות באמצעות מיקרוסקופ זריחה על פי הוראות היצרן, עם מסנן עירור שיא מוגדר 594 ננומטר. 8. תא תרבות על משטחים nanofabricated להכין השעיה של hMSCs טוב מאופיין שבין 4 אתth ומעברה 6. 24 להשעות בקבוקון confluent של תאים על ידי שטיפה פעם עם 10 מ”ל PBS מביצועם תאים מודבקת על-ידי הוספת 5 מ של טריפסין/EDTA לתוך הבקבוק תרביות רקמה T75, דגירה את הבקבוק בתוך תא humidified ב 37 ° C בתוספת 5% CO2 עד 5 דקות עד 90% o f התאים מנותקים מן השטח. לאחר מכן, להוסיף 6 מ של טרי תרבות המדיה המכילה 10% עגל עוברית סרום (FCS) לתוך הבקבוק ולשטוף בקצרה את הבקבוק עם התקשורת הוסיף. העברת תא ההשעיה לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ”ל צנטריפוגה-400 גרם ב 25 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות. הסר את תגובת שיקוע, resuspend תא גלולה ב- 3 מ”ל של מדיה תרבות טריים. לספור את צפיפות התא באמצעות hemocytometer של25 ולהתאים את הצפיפות של התליה תא 2 x 104 תאים/מ ל… על ידי התוספת של אמצעי אחסון המתאים של תרבות התקשורת. הזרע התאים על גבי מצעים-צפיפות של תאים/cm 104 2. חותכים את המצע 1 x 1 ס מ2 עם יהלום הסופר ולמקם אותו לבאר בצלחת תרביות רקמה 12-. טוב. פיפטה 2 מ”ל של השעיה תא בתקשורת תרבות (מתוך שלב 8.1.4) לתוך הבאר, דגירה בתוך תא humidified ב 37 ° C בתוספת 5% CO2 במשך 24 שעות ביממה. לאחר גידול תאים על הדפוסים, לנתח את היקף התא מצורף והפצת מאת immunofluorescence: הסר מדיה, לכבס מצעים פעם אחת עם PBS. לתקן תאים עם 2 מ ל פתרון של 4% paraformaldehyde ב- PBS (טרום התחמם עד 37 ° C) במשך 20 דקות fume הוד, שטיפת שלוש פעמים עם PBS.התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל. אנא קרא MSDS לפני עבודה עם הפתרון הזה. ציוד בטיחות חובה לחבוש בזמן הטיפול הכימי. Permeabilize התאים עם 2 מיליליטר תמיסת דטרגנט 0.5% (ראה טבלה של חומרים) ב- PBS למשך 15 דקות, לשטוף לאחר מכן שלוש פעמים עם PBS. להטביע את המצע ב 2 מ ל פתרון של ארנב unconjugated anti-fibronectin נוגדן ראשוני-דילול בטחונות עם 5% (w/v) BSA ב- PBS, דגירה ב 4 ° C עבור 16 h, לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 0.1% (v/v) Tween 20 ב- PBS (PBST). לאחר מכן להטביע את המצע ב 2 מיליליטר תמיסת fluorescently מצומדת ארנב אנטי משני נוגדנים (מדולל עם 5% (w/v) BSA ב- PBS ב דילול המצוין של היצרן, 2 טיפות/mL), לכסות בנייר, דגירה בטמפרטורת החדר לשעה לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם 0.1% PBST. להוספת תווית אקטין חוטים, להטביע 2 מ של phalloidin fluorescently מצומדת לדילול 1:250 ב- PBS, לכסות בנייר, דגירה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לאחר מכן לשטוף שלוש פעמים עם PBS. במקביל כתם גרעין התא והר המצע על-ידי החלת טיפה של הרכבה דאפי המכיל בינונית ולכסות עם coverslip. דמיינו תאים באמצעות מיקרוסקופ זריחה על פי הוראות היצרן, מסננים עירור של 365 nm עבור גרעינים (דאפי), 488 ננומטר F-אקטין, 594 nm עבור fibronectin.

Representative Results

כדי לבדוק היישור האוטומטי היה מוצלח, נבחנו הגרפים המותווים מתוך נתוני יישור (בגיליון מהשלב 4.8). שם תהליך יישור הצליחה שתי החלקות, המתאימים לזווית שבו הבמה לדוגמה יש כבר מוטה לאורך הצירים θ באמצעות וφ, הראה סדרה של בעליה וירידה נקודות נתונים. בכל אחת החלקות, שני מתאים ליניארי של נקודות הנתונים הראה מוגדרים היטב על המחשב המשולב “שיא” המציין את מרבית z-את הזווית המתאימה שבה היה יישור והסיומת מושגת (איור 4A , 4B). תהליך זה הוא חוזרות ארבע פעמים (כלומר, פעמיים על כל ציר), התווה ארבע נקודות ציון. נקודת ההצטלבות בין כל זוג של נקודות הציון ובכך מראה הזוויות הכולל אופטימום (איור 4C). 13 במקרים שבו היישור לא היה מוצלח, זה יכול להיות שנצפו כי θ באמצעות המתאימים וחלקות הזווית φ שלהם לא נותנים מתאים ליניארי באיכות טובה, או שאינם נחתכים (איור 5). היישורים כושל כזה בדרך כלל כתוצאה מערכי של להיות קצוץ באופן לא תקין או רכוב על המחזיק בדיקה (שלבים 1.7, 1.8 ו- 2.2). במקרים אלה, מערכי של שנמחקו, אחד חדש שהוכן רכוב (שלבים 1 ו- 2) ו תהליך יישור חוזרות (שלב 4). יישור מוצלחת ועל ליתוגרפיה עם מנהל מאת PPL, מצעים זהב בדוגמת היו אז עם תמונה באמצעות מיקרוסקופ כוח לרוחב לבחון התצהיר התרחש. בדיקה אזור גדול של משטחים המודפס נערך גם על ידי מיקרוסקופ אופטי של סובסטרטים לאחר איכול הזהב אינו מוגן על ידי תיול הפקיד (איור 6 ואיור 7). עם זאת, הדפוסים חרוט אינם יכולים לשמש עבור עוד יותר functionalization, ניתן להשתמש בו רק כדי לאשר המתבנת על מדגמים מייצגים של אצווה של סובסטרטים השטח המודפס. אם התבניות חרוט להראות אזורים ריקים המייצגים עטים בודדים (איור 8), תוצאה זו עולה כי הייצור של מערכי בדיקה לא סיים בהצלחה, וכי הגששים כמה הם פגומים או חסרים. זה inhomogeneity של הגששים יכול להיות בגלל השימוש הציירים הגדולים שבהם הציפוי perfluorinated שחק (שלב 1.3), וכתוצאה מכך כמה הגששים נקרעת משם כאשר המערך מופרדת מן המאסטר. במקרים אלה, אדון חדש אמור לשמש. התוצאה יכול להיות גם בגלל הנוכחות של אוויר בועות לכוד בין הזכוכית גיבוי והמאסטר (שלב 1.5), או אם המערך בדיקה לא נקיה הופרד מהמאסטר לאחר ריפוי (שלב 1.8). מיקרוסקופ נמכרות התמונות של משטחים fibronectin functionalized hMSCs מתפשט היו גם שנאספו (איור 9). באופן כללי, הכל מצעים היו יציבים בתוך הסביבה תרבות במבחנה , התאים דבקה ומותאמים שלהם מורפולוגיה לתבניות המודפסות במקרה של קטן מבודד 20 x 20 מערך של תכונות. איור 1. ייצוג סכמטי של פולימר עט ליתוגרפיה מראה דיו מולקולרית תחבורה באמצעות מניסקוס מים על קצה המקדח. (א) מבט צד, מבט מלמעלה (ב) של המערך עט פולימרי מציינים כי כאשר בדיקת array ו משטח המצע מיושרים באופן מלא, כל הגששים לבוא במגע עם המשטח בו זמנית, וכתוצאה מכך ליתוגרפיה ויישומי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. באיור 2. תרשים סכמטי של פולימר עט ליתוגרפיה להגדיר האם (א) מבט צד מורחבת ניסיוני להגדיר איפה המערך מוכן בדיקה מצורף כדי לחקור מחזיק, רכוב על הסורק AFM. המצע מושם על הבמה, להלן אשר ממוקמים שלושת בכוח חיישנים. (ב) ייצוג של מכשור התאספו, מציג ראש הסריקה AFM ביחס השלב מדגם. התצוגה התחתונה (ג) חיל חיישן מיקום מציג. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3. ייצוג סכמטי המתאר את התוכנית ספקטרוסקופיה שהפרוצדורה יישור. הסורק AFM מוגדר להעביר את הגששים לכיוון לדוגמה על-ידי למרחק של 10 מיקרומטר בתוך 100 ms, שהתקיים עמדה עבור 250 ms, ואחריו הכחשה של 10 מיקרומטר בתוך 100 ms, והחזיק מכן עבור ms 250 במיקום שקועה. ההצעה ואז חוזרת לאורך כל תהליך היישור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. באיור 4. גרפים הממחישות יישור מוצלחת של. גרפים של מיקום z נגד הטיה זוויות (א) θ באמצעות, (ב) φ ליישור מוצלחת, איפה ● מציין נמדדו הערכים הממשיים ומציין + הכי מתאים באמצעות שיטת הריבועים הפחותים. (ג) גרף של φ נגד θ באמצעות מצויד זוויות עם ארבע נקודות איפה z-המיקום המירבי הושג. נקודת ההצטלבות מסומן הוא הזווית הסופי הטיה אופטימלית לאורך שני הצירים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5. גרפים הממחישות ישור כושל. גרפים של מיקום z נגד הטיה זוויות (א) θ באמצעות φ (B) עבור ישור כושל, איפה ● מציין נמדדו הערכים הממשיים ומציין + הטוב ביותר להתאים את שיטת הריבועים הפחותים. (ג) גרף של φ נגד θ באמצעות מצויד זוויות עם ארבע נקודות איפה z-המיקום המירבי הושג. אין אופטימה ברורה או נקודת ההצטלבות שנצפו, לכן הזוויות אופטימום היישור לא נפתרים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 6. מיקרוסקופ אופטי המחשה ותמונות של מיקרוסקופ כוח אטומי של סובסטרטים זהב היו בדוגמת עם מנהל על ידי מערכי PPL המיושרת של, ואז חרוט. (א) ו- (ב) הם תמונות ברצף המוגדל מיקרוסקופ אופטי של הדפוסים חרוט; (ג) היא תמונה הטופוגרפיה AFM של רשת יחיד של תבניות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 7. תמונות המחשה מיקרוסקופ אופטי של סובסטרטים זהב היו בדוגמת עם מנהל על ידי מערכי PPL המיושרת של, ואז חרוט. (א) ו- (ב) הם תמונות ברצף המוגדל מיקרוסקופ אופטי של דפוסי חרוט והוא (ג) תמונה הגדלה נמוכה יותר, המציג את שטח גדול דפוסי הומוגנית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 8. תמונת המחשה מיקרוסקופ אופטי של מצע זהב היה לצר בדוגמת עם מנהל ולאחר מכן חרוט. הדפוסים המיועד (מוצג באותיות שיבוץ) היו חוזרים רשתות קווי נקודה 20 מסודרים קווים 20, עם כל שתי שורות המיוצרים על ידי הגדלת את z-הרחבת ציר מאת 1 מיקרומטר (הנע בין 5 ל-5 µm). ניתן לראות כי באזורים מסוימים אין דפוסי נוצרים, עקב חסר הגששים במיקומים אלה. באזורים שבהם מיוצרים רק שתי שורות של נקודות, תוצאה זו עולה כי בדיקה קיים אבל זה לא באותו גובה כמו הגששים לתפקוד מלא, כך פיקדון בלבד כולל כאשר המערך יורחב כך מלא z-ציר המרחק. בתמונה זו, הניגוד שונתה בכוונה כדי לאפשר תצפית של האזורים חלקית המודפס. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 9. Epifluorescence תמונות מיקרוסקופ של hMSCs תרבותי במערכים fibronectin בתבניות על ידי PPL. (א) ו (ב) הם תמונות בהגדלה הצגה לתאים בודדים. (ג) מציג תבנית דוגמה של המערך fibronectin ללא חסיד תא ו- (ד) הוא תמונת שדה רחב של התאים תרבותי בתצוגת רשת (סכימטי של התבנית המודפסת היא גם שמוצג שיבוץ). התאים מוכתמים כדי להראות fibronectin (אדום), F-אקטין (ירוק) ותא גרעינים (כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פרוטוקול זה משמש כדי לספק למשתמשים מתודולוגיה נוח לבצע במהירות nanolithographic תכנים אחידות גבוהה וגודל תכונה לשליטה על גדול אזורים (2ס מ). מצעים הנושאת אלה nanopatterns שטח גדול יכול אז להיות כתביעות למגוון רחב של יישומים. אחד היישומים העיקריים של טכנולוגיה זו הוא דור של משטחים nanofabricated ללימודי תא-פני אינטראקציה. דוח זה מציג כמה דוגמאות להמחשה של תרבית תאים על חומרים אלה, הפגנת שליטה על מורפולוגיה hMSC מאת nanofabricated סובסטרטים.

לתמוך מפתח של פרוטוקול זה הוא האוטומציה של ההליך יישור (שלב 4) המאפשר ייצור מאוד אחידה, תפוקה גבוהה של תכונות על משטחים, עד רזולוציה ננו, שמאפשר תחלופת מהירה של ניסויים התרבות התא. הדפס אבן העט פולימר מתבצעת באמצעות אלגוריתם יישור זה הוא מסוגל לייצר ננו התכונות בתוך כ 30 דקות. הפארמצבטית ואת הדיוק של יישור אוטומטי, ובכך האחידות של התכונות בדוגמת, הוא אולם אנושות התלוי על האיכות של המערכים בדיקה כי הם יוצרו (שלב 1 ו-2). פגמים בהכנה שלהם כי התוצאה הגששים בוטה, שבור או חסר; כגון אוויר לכוד בועות (שלב 1.5), או פסולים הפרדת הגששים מתבנית הבסיס (שלב 1.8) יכול לגרום יישור לא מדויק, ליתוגרפיה באיכות ירודה.

זה דיווח שיטת מניות מגבלה במשותף עם שיטות אחרות יישור המסתמכים על משוב. הקביעה מדויקת של מתי הגששים נמצאים בקשר עם פני השטח מוגבל בשל הצורך להביא בחשבון רקע ויברציות הנגרמת על ידי הסביבה הסביבה והתנועה של השלב הדגימה. באופן כללי, החיישנים יש רגישות כוח המשטר µN (2 µN במקרה זה), אבל האלגוריתם יישור נועד רק להירשם לכח µN 490 לפחות כאיש קשר סופית את הגששים בין פני השטח, על מנת למנוע כל תוצאות הבדיקות של ‘תוצאות חיוביות שגויות’ טינג מרעש הרקע. 13 כך, שיטה זו נוטה לייצר תכונות גדול (1-2 מיקרומטר) מאז הגששים חייב מורחב מרחק גדול z-ציר (עם כוח גבוה הסוגר) כדי להירשם קשר. כדי לפצות, תכונות קטן יכול להיווצר על-ידי הפחתת את z-ציר מרחק נסע במהלך השלב הדפס אבן (למשל, הזנת את ההגדרה ‘שחור’ בשלב 5.2.3.2 כמו מיקרומטר 3 במקום 5 מיקרומטר).

ובכל זאת, אפילו עם מגבלה זו, אוטומציה האלגוריתם הוא מסוגל לטפל היבט קריטי ביישום של ויישומי סריקה בדיקה שיטות ליתוגרפיה, כמו יישור היה בעבר הכי תובעני ולא מדויק הצעד ב יישום של טכניקות אלה. אוטומציה הזה עכשיו עובר לשלב הגבלת קצב של תהליך ייצור מ היישור לכתוב ליטוגרפית עצמה. בעוד פרוטוקול זה מדגים היישום של הליך היישור כדי PPL, המסגרת יכול לחול על מספר טכניקות SPL כגון שומנים בדם-DPN26 , ליתוגרפיה בסיוע מטריקס27 , כמו גם העתיד פוטנציאל קטליטי מערכות בדיקה. 28

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים לאשר תמיכה כספית ממגוון רחב של מקורות כולל את בריטניה הנדסת ולהעניק המועצה למחקר מדעי (השופט. EP/K011685/1, EP/K024485/1) ו- studentship לתואר שני עבור JH; הקרן Leverhulme (RPG-2014-292); קרן תמיכה אסטרטגית מוסדית טרסט (105610/ת/14-ת); המועצה הבריטית (216196834); אוניברסיטת מנצ’סטר עבור אוניברסיטה של מכון המחקר מנצ’סטר (UMRI משאבת לקרקע קרן), מלגת הדוקטורט לנשיאות לסיוע טכני SW. על ידי ד ר אנדריאס ליב (Nanosurf AG) הוא הודה גם בהכרת תודה.

Materials

Equipment
FlexAFM mounted on a motorised 5-axis (XYZΘΦ) translation and goniometer stage NanoSurf P40008
AFM control software NanoSurf C3000
Engraving pen Sigma-Aldrich Z225568
Plasma Cleaner Harrick plasma PDC-32G-2
PlasmaFlo Harrick plasma PDC-FMG-2
Economy Dry Oxygen Service Pump Harrick plasma PDC-OPE-2
Tube Rotator Stuart SB3
Vacuum Desiccator Thermo Fisher Scientific 5311-0250
Milli-Q Water Purification System Merck Millipore ZRXQ015WW
Modular Humidity Generator proUmid MHG32
Proline Plus Pipette 100-1000 µL Sartorius 728070
Silicon masters NIL Technology custom-made
Upright snapshot fluorescence microscope Olympus BX51
Microscope objectives Olympus 10x and 60x UPlan FLN ∞/-/FN 26.5
Upright bright field microscope Leica DM 2500M
Ultrasonicator Ultrawave Ltd. U95
Spreadsheet for recording and intepreting automated alignment results Microsoft Excel
Reagent
2-propanol Sigma-Aldrich 34863 FLAMMABLE
Microscope Sildes, Clear, Ground Thermo Fisher Scientific 451000
(7–8% vinylmethylsiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxy-terminated Gelest VDT-731
1,3,5,7-tetramethyl-1,3,5,7-tetravinylcyclotetrasiloxane Gelest SIT7900.0
Platinum(0)-1,3-divinyl-1,1,3,3-tetramethyldisiloxane complex solution Sigma-Aldrich 479527 HARMFUL, TOXIC
(25–35% methylhydrosiloxane)-dimethylsiloxane copolymer, trimethylsiloxane-terminated Gelest HMS-301
Weigh Boat 100 mL Scientific Laboratory Supplies BALI828
Pasteur pipette Appleton Woods KS230
Petri dish SARSTEDT 82.1473
Razor blade Thermo Fisher Scientific ST10-031T
Adhesive Carbon Tape Agar scientific AGG3939
16-Mercaptohexadecanoic acid Sigma-Aldrich 448303-1G HARMFUL, TOXIC
Ethanol Sigma-Aldrich 34852 FLAMMABLE
Gold coated microscope slide Sigma-Aldrich 643203 Once opened gold will remain reactive to thiols for at least 1 month
Thiourea Sigma-Aldrich T8656 HARMFUL, TOXIC
Iron(III) nitrate nonahydrate Sigma-Aldrich 529303 HARMFUL, TOXIC
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 84415 HARMFUL, TOXIC
(11-Mercaptoundecyl)hexa(ethylene glycol) Sigma-Aldrich 675105 HARMFUL, TOXIC
Fibronectin from human plasma Sigma-Aldrich F0895
Cobalt(II) nitrate hexahydrate Sigma-Aldrich 203106 HARMFUL, TOXIC
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Sigma-Aldrich D8537
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium Lonza UK PT-3001
Human Mesenchymal Stem Cells Lonza UK PT-2501
Trypsin-EDTA Sigma-Aldrich T4174
Heraeus Multifuge X1 Centrifuge Thermo Fisher Scientific 75004210
CELLSTAR Centrifuge Tubes Greiner Bio-One 188261
Paraformaldehyde Fisher Scientific P/0840/53 HARMFUL, TOXIC
Alexa Fluor 488 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A12379
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 "Detergent" in manuscript
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200
Rabbit anti-fibronectin antibody Abcam ab2413
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 Thermo Fisher Scientific R37117
Bovine Serum Albumin Sigma-Aldrich A3912
12-well plate Thermo Fisher Scientific 10253041
T75 tissue culture flask Thermo Fisher Scientific 10790113
cantilever BudgetSensor ContAl-G
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Saavedra, H. M., et al. Hybrid Strategies in Nanolithography. Rep. Prog. Phys. 73, 036501 (2010).
  2. Gates, B. D., et al. New Approaches to Nanofabrication: Molding, Printing, and Other Techniques. Chem. Rev. 105, 1171-1196 (2005).
  3. Garcia, R., Knoll, A. W., Riedo, E. Advanced Scanning Probe Lithography. Nat. Nanotechnol. 9, 577-587 (2014).
  4. Piner, R. D., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. A. “Dip-Pen” Nanolithography. Science. 283, 661-663 (1999).
  5. Salaita, K., Wang, Y., Mirkin, C. A. Applications of Dip-Pen Nanolithography. Nat. Nanotechnol. 2, 145-155 (2007).
  6. Lewis, A., et al. Fountain Pen Nanochemistry: Atomic Force Control of Chrome Etching. Appl. Phys. Lett. 75, 2689-2691 (1999).
  7. Kim, K. -. H., Moldovan, N., Espinosa, H. D. A Nanofountain Probe with Sub-100 Molecular Writing Resolution. Small. 1, 632-635 (2005).
  8. Gruter, R. R., Voros, J., Zambelli, T. FluidFM as a Lithography Tool in Liquid: Spatially Controlled Deposition of Fluorescent Nanoparticles. Nanoscale. 5, 1097-1104 (2013).
  9. Salaita, K., et al. Massively Parallel Dip-Pen Nanolithography with 55 000-Pen Two-Dimensional Arrays. Angew. Chem. Int. Ed. 45, 7220-7223 (2006).
  10. Huo, F., et al. Polymer Pen Lithography. Science. 321, 1658-1660 (2008).
  11. Shim, W., et al. Hard-Tip, Soft-Spring Lithography. Nature. 469, 516-520 (2011).
  12. Liao, X., Braunschweig, A. B., Mirkin, C. A. “Force-Feedback” Leveling of Massively Parallel Arrays in Polymer Pen Lithography. Nano Lett. 10, 1335-1340 (2010).
  13. Wang, S., Hosford, J., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-Area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment of Probe Arrays. RSC Adv. 5, 61402-61409 (2015).
  14. Noh, H., et al. “Multipoint Force Feedback” Leveling of Massively Parallel Tip Arrays in Scanning Probe Lithography. Small. 11, 4526-4531 (2015).
  15. Dalby, M. J., et al. The Control of Human Mesenchymal Cell Differentiation Using Nanoscale Symmetry and Disorder. Nat. Mater. 6, 997-1003 (2007).
  16. Connell, C. D., Higgins, M. J., Moulton, S. E., Wallace, G. G. Nano-Bioelectronics via Dip-Pen Nanolithography. J. Mater. Chem. C. 3, 6431-6444 (2015).
  17. Giam, L. R., et al. Scanning Probe-Enabled Nanocombinatorics Define the Relationship Between Fibronectin Feature Size and Stem Cell Fate. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 4377-4382 (2012).
  18. Eichelsdoerfer, D. J., et al. Large-Area Molecular Patterning with Polymer Pen Lithography. Nat. Protoc. 8, 2548-2560 (2013).
  19. Aran, K., Sasso, L. A., Kamdar, N., Zahn, J. D. Irreversible, Direct Bonding of Nanoporous Polymer Membranes to PDMS or Glass Microdevices. Lab Chip. 10, 548-552 (2010).
  20. Liao, X., Braunschweig, A. B., Zheng, Z., Mirkin, C. A. Force- and Time-Dependent Feature Size and Shape Control in Molecular Printing via Polymer-Pen Lithography. Small. 6, 1082-1086 (2010).
  21. Sheehan, P. E., Whitman, L. J. Thiol Diffusion and The Role of Humidity in “Dip Pen Nanolithography”. Phys. Rev. Lett. 88, 156104 (2002).
  22. Geissler, M., et al. Fabrication of Metal Nanowires Using Microcontact Printing. Langmuir. 19, 6301-6311 (2003).
  23. Gmeiner, B., Leibl, H., Zerlauth, G., Seelos, C. Affinity Binding of Distinct Functional Fibronectin Domains to Immobilized Metal Chelates. Arch. Biochem. Biophys. 321, 40-42 (1995).
  24. Curran, J. M., et al. Introducing Dip Pen Nanolithography as a Tool for Controlling Stem Cell Behaviour: Unlocking the Potential of the Next Generation of Smart Materials in Regenerative Medicine. Lab Chip. 10, 1662-1670 (2010).
  25. Davey, M. R., Anthony, P. . Plant Cell Culture: Essential Methods. , 153-172 (2010).
  26. Brinkmann, F., et al. Interdigitated Multicolored Bioink Micropatterns by Multiplexed Polymer Pen Lithography. Small. 9, 3266-3275 (2013).
  27. Senesi, A. J., Rozkiewicz, D. I., Reinhoudt, D. N., Mirkin, C. A. Agarose-Assisted Dip-Pen Nanolithography of Oligonucleotides and Proteins. ACS Nano. 3, 2394-2402 (2009).
  28. Carnally, S. A. M., Wong, L. S. Harnessing Catalysis to Enhance Scanning Probe Nanolithography. Nanoscale. 6, 4998-5007 (2014).

Tags

Large-area Scanning Probe NanolithographyAutomated AlignmentSubstrate FabricationCell Culture StudiesPDMS PrepolymerSilicon MasterPPL ArrayOxygen Plasma TreatmentAFM Lithography

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lee, I., Hosford, J., Wang, S., Hunt, J. A., Curran, J. M., Heath, W. P., Wong, L. S. Large-area Scanning Probe Nanolithography Facilitated by Automated Alignment and Its Application to Substrate Fabrication for Cell Culture Studies. J. Vis. Exp. (136), e56967, doi:10.3791/56967 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image