Neuron-makrofag samtidig kulturer att aktivera makrofager utsöndrar molekylära faktorer med Neurite utväxt aktivitet
Summary
Det nuvarande protokollet presenterar experimentella rutiner för att stimulera odlade makrofager utrustas med kapacitet att släppa molekylära faktorer som främjar neurite utväxt. Behandling av lägret till neuron-makrofag samtidig kulturer inducerar makrofager att producera luftkonditionerade medium som besitter starka neurite utväxt aktivitet.
Abstract
Det finns starka bevis att makrofager kan delta i regenerering eller reparation av skadade nervsystemet. Här beskriver vi ett protokoll där makrofager förmås att producera luftkonditionerade medium (CM) som främjar neurite utväxt. Adult dorsalrotsganglier ganglion (DRG) nervceller är akut skiljas och förkromad. När nervceller bifogas stabilt, är peritoneal makrofager samtidig odlade på en cell kultur infoga överlagras på samma väl. Dibutyryl cykliskt AMP (db-cAMP) tillämpas samtidig kulturer för 24 h, varefter cellkulturen infoga innehållande makrofager flyttas till en annan brunn att samla CM för 72 h. CM från samtidig kulturer behandlas med db-lägret, när de appliceras på en separat vuxen DRG neuron kultur, utställningar robust neurite utväxt aktivitet. Den CM erhålls från db-cAMP-behandlade kulturerna bestående av encellig typ ensam, antingen DRG neuron eller peritoneal makrofag, inte uppvisar neurite utväxt aktivitet. Detta indikerar att samspelet mellan nervceller och makrofager är oumbärlig för aktivering av makrofager utsöndrar molekylära faktorer med neurite utväxt aktivitet i CM. Vårt samarbete kultur paradigm kommer således också vara användbart att studera intercellulära signalering i neuron-makrofag samspelet att stimulera makrofager utrustas med en pro-regenerativ fenotyp.
Introduction
En mängd studier har försökt att förbättra CNS axon regeneration efter skador i ryggmärgen eller hjärnan. Inflammatoriska reaktioner, oundvikligen åtföljer skadorna i nervsystemet, anses traditionellt delta i sekundära sjukdomsprocesser som leder till skadliga resultat1,2. Metylprednisolon som kan dämpa inflammatoriska reaktioner är faktiskt den enda godkända terapin för akut ryggmärgen skadan3. Nyare studier har emellertid lämnat bevis att makrofager, en typ av representativa inflammatoriska celler, kan delta i regenerering eller reparation av skadade nervsystemet4,5,6. Till exempel infiltrera makrofager efter en objektiv skada producera pro-regenerativ molekyler att främja regenerering av retinal ganglion nervceller7,8. Dessutom ökade transplanterade DRG nervceller axon tillväxten upp regionen där makrofager aktiverades av zymosan9. Makrofager på webbplatsen lesion kan dessutom skapa en tillväxt-tillåtande miljö för skadade perifera nerver10.
Vårt arbete har också starka bevis som makrofager kan bidra till kapaciteten hos axon förnyelse i intilliggande nervceller. Vi har visat att aktivering av makrofager i de dorsala rotganglier (DRG) var väsentliga i den ökade regenerativa kapaciteten av DRG sensoriska nervceller efter en prekonditionering perifer nerv skada11. Liknande forskning rapporterades självständigt från ett annat laboratorium12. Vi visade också att intraganglionic injektion av dibutyryl cykliskt AMP (db-cAMP), som är en välkänd molekyl att förbättra kapaciteten hos axon regenerering13, inducerad aktivering av makrofager. Avaktivering av makrofager avskaffat effekterna av db-lägret på neurite utväxt aktivitet. Efterföljande verk identifierade nervskade-inducerad uttryck för CCL2 i nervceller som en signal att stimulera makrofager med en pro-regenerativ fenotyp14,15.
Baserat på ovanstående experimentella resultat, har vi etablerat en in vitro- modell som liknar molekylära händelser som inträffar i de DRGs efter en prekonditionerande skada modell11,14. I denna modell används db-cAMP till neuron-makrofag samtidig kulturer framkalla intercellulära signalering som leder till aktivering av makrofager med en pro-regenerativ fenotyp. Här beskriver vi detaljerade protokoll genom vilket vi kan generera makrofager som utsöndrar molekylära faktorer som främjar neurite utväxt (figur 1). Detta experimentella modellen illustrerar ett koncept att makrofager kan stimuleras eller förmås att stödja axon regeneration efter skador på nervsystemet. Vår modell kommer också vara användbart för att studera mekanismer i intercellulära signalering som leder till aktivering av pro-regenerativ makrofager.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera kritiska steg för generering av detta samarbete kultur system. Det är viktigt att se till att den musen DRG nervceller och peritoneal makrofager är beredda färska och hälsosamma. Vi har upplevt minskad neurite utväxt aktivitet cm när dissektion av alla DRGs tog mer än 30 min. Dessutom kontaminering av blodkomponenter i peritoneal makrofager också lett till en minskning av neurite utväxt aktivitet i CM. För att framkalla robust neuron-makrofag interaktion av db-cAMP, grundlig tvätt skulle ocks?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta protokoll stöds av bidrag NRF-2015R1A2A1A01003410 från ministeriet för vetenskap, IKT och framtida planering, Sydkorea.
Materials
| Cell culture insert transparent PET membrane 0.4μm pore size | Corning,Falcon | 353090 | Transparent PET membrane with 0.4-μm pore size, for 6-well plate |
| 70-μm nylon cell strainer | Corning, Falcon | 352350 | |
| 8-well culture slide | Biocoat | 354632 | with a uniform application of Poly-D-Lysine |
| Red blood cell lysis buffer | Qiagen | 158904 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9407-100MG | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 21103-049 | Containing 1% glutamax and 1% penicilin-streptomycin |
| B-27 supplement, serum free | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 17504-044 | extracellular solution |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin-streptomycin | Thermo Fisher Scientific, Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | |
| Laminin | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | 23017-015 | |
| Adenosine 3', 5'-cyclic monophosphate, N6,O2'-dibutyryl-, sodium salt | Merck Millipore Corporation, Calbiochem | 28745 | |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 16210072 | |
| Triton-X-100 | Daejung Chemical and Metal Co | 8566-4405 | |
| Anti β III tubulin (Tuj-1) | Promega Corporation | G7121 | Mouse monoclonal antibody |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher Scientific, Invitrogen | A11005 | |
| Hemacytometer | Marienfeld-Superior | N/A | |
| Cell culture CO2 incubator | Panasonic | N/A | |
| Dissecting stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi DV4 | |
| Twist shaker | FINEPCR | Tw3t | |
| Tabletop centrifuge | Sorvall | N/A | |
| Confocal microscope | Olympus America Inc | IX71 | |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | VWR International, Hyclone | SH30919.03 | |
| Friedman Pearson Rongeurs | FST (Fine Science Tools) | 16021-14 | Stainless steel, 14cm, curved, single joint action |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide & ToughCut | FST (Fine Science Tools) | 14558-11 | sharp, serrated |
| Dumont #7 Forceps | FST (Fine Science Tools) | 11272-30 | Dumoxel, 0.07 x 0.04mm, curved |
| Vannas Spring Scissors | FST (Fine Science Tools) | 15000-00 | straight, 3mm cutting-edge, sharp |
| Qualitron DW-41 Micro-Centrifuge | Artisan Technology Group | DW-41 | Input Voltage: 115VAC |
References
- Donnelly, D. J., Popovich, P. G. Inflammation and its role in neuroprotection, axonal regeneration and functional recovery after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 378-388 (2008).
- Festoff, B. W., et al. Minocycline neuroprotects, reduces microgliosis, and inhibits caspase protease expression early after spinal cord injury. J Neurochem. 97 (5), 1314-1326 (2006).
- Bowers, C. A., Kundu, B., Hawryluk, G. W. Methylprednisolone for acute spinal cord injury: an increasingly philosophical debate. Neural Regen Res. 11 (6), 882-885 (2016).
- Gensel, J. C., Kigerl, K. A., Mandrekar-Colucci, S. S., Gaudet, A. D., Popovich, P. G. Achieving CNS axon regeneration by manipulating convergent neuro-immune signaling. Cell Tissue Res. 349 (1), 201-213 (2012).
- DiSabato, D. J., Quan, N., Godbout, J. P. Neuroinflammation: the devil is in the details. J Neurochem. 139 Suppl 2, 136-153 (2016).
- Jin, X., Yamashita, T. Microglia in central nervous system repair after injury. J Biochem. 159 (5), 491-496 (2016).
- Yin, Y., et al. Macrophage-derived factors stimulate optic nerve regeneration. J Neurosci. 23 (6), 2284-2293 (2003).
- Yin, Y., et al. Oncomodulin is a macrophage-derived signal for axon regeneration in retinal ganglion cells. Nat Neurosci. 9 (6), 843-852 (2006).
- Gensel, J. C., et al. Macrophages promote axon regeneration with concurrent neurotoxicity. J Neurosci. 29 (12), 3956-3968 (2009).
- Barrette, B., et al. Requirement of myeloid cells for axon regeneration. J Neurosci. 28 (38), 9363-9376 (2008).
- Kwon, M. J., et al. Contribution of macrophages to enhanced regenerative capacity of dorsal root ganglia sensory neurons by conditioning injury. J Neurosci. 33 (38), 15095-15108 (2013).
- Niemi, J. P., et al. A critical role for macrophages near axotomized neuronal cell bodies in stimulating nerve regeneration. J Neurosci. 33 (41), 16236-16248 (2013).
- Hannila, S. S., Filbin, M. T. The role of cyclic AMP signaling in promoting axonal regeneration after spinal cord injury. Exp Neurol. 209 (2), 321-332 (2008).
- Kwon, M. J., et al. CCL2 Mediates Neuron-Macrophage Interactions to Drive Proregenerative Macrophage Activation Following Preconditioning Injury. J Neurosci. 35 (48), 15934-15947 (2015).
- Niemi, J. P., DeFrancesco-Lisowitz, A., Cregg, J. M., Howarth, M., Zigmond, R. E. Overexpression of the monocyte chemokine CCL2 in dorsal root ganglion neurons causes a conditioning-like increase in neurite outgrowth and does so via a STAT3 dependent mechanism. Exp Neurol. 275 Pt 1, 25-37 (2016).
- Cafferty, W. B., et al. Conditioning injury-induced spinal axon regeneration fails in interleukin-6 knock-out mice. J Neurosci. 24 (18), 4432-4443 (2004).
- Cai, D., et al. Neuronal cyclic AMP controls the developmental loss in ability of axons to regenerate. J Neurosci. 21 (13), 4731-4739 (2001).
- Neumann, S., Woolf, C. J. Regeneration of dorsal column fibers into and beyond the lesion site following adult spinal cord injury. Neuron. 23 (1), 83-91 (1999).
