X-선 사이 누화를 조사 하는 공동 문화 방법을 반구 Caco-2 셀 및 PBMC

다음 프로토콜 건강 한 지원자에서 인간의 피 철수를 포함 한다. 기증자 등록 사전 서 면된 동의 제공합니다. 이 절차는 헬싱키 선언에 따라 그리고 혈액 인출 전문 의료 조 수에 의해 수행 되었다. 1. 세포 문화 및 공동 문화 설정 1 주일 전에 방사선, 2.5 × 105 셀/mL와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스 보충 하는 신선한 RPMI1640 매체에 포함 된 Caco-2 셀 서 스 펜 션 준비. 종자의 살 균 1 µ m 기 공 직경 세포 배양에서 세포 현 탁 액 2 mL 6 잘 플레이트에 대 한 삽입 하 고 삽입 6 잘 플레이트에 넣어.참고: 셀 문화 삽입 셀 뿌리기 전에 메 마른 완전 한 매체를 가진 외피에 의해 활성화 해야 합니다. 이 경우에, 문화 미디어 삭제 하 고 셀 서 스 펜 션 미디어로 대체 되어야 한다. 10 S, 2 mM L-글루타민, 100 IU/mL 페니실린, 및 각 바닥 구획, 100 µ g/mL 스 보충 하는 신선한 RPMI1640 매체의 3 mL를 추가 하 고 습도 분위기 5% CO2를 포함 하는 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 문화. Caco-2 셀 방사선의 같은 날, 상용 리튬-헤 파 린 코팅 6 mL 튜브에 인간의 전체 혈액 수집 (튜브 크기: 13 x 100 m m). 그 후, Ficoll 기울기를 사용 하 여 주변 혈액 단 세포 (PBMC)를 격리 합니다. PBMC를 분리, 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 및 레이어 전체 혈액의 동일 볼륨 Ficoll 25 mL를 넣어 Ficoll 표면에 RPMI1640와 함께 1:1 희석.참고: 정상적인 건강 한 기증자는 일반적으로 약 4-10 × 106 PBMC/mL 있다. 실 온에서 30 분 400 x g에서 50 mL 튜브 원심 부드럽게 파스퇴르 피 펫과 포부에 의해 Ficoll와 플라즈마 사이의 인터페이스에서 PBMC를 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 넣어. 두 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 10 mL를 추가 하 여 10 분 동안 250 x g에서 PBMC centrifuging에서 PBMC를 씻어. 문화 PBMC T25 h 조 3-5의 최대 c m2 플라스 크에서 완료 하기 전에, 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 설명한 대로 RPMI1640 미디어.참고: 실험 당일 PBMC를 수집 하 고 2 × 106 셀/글쎄, 공동 문화의 아래쪽 구획에서 완전 한 RPMI1640 매체의 3 mL에 씨앗. Caco-2 셀 삽입 PBMC 포함 된 웰 스 30 분 그들의 방사선 조사 후 전송 됩니다. PBMC 전체 혈액에서 수집 수 없습니다 수 이상 약 72 h에 대 한 문화에서 유지 아니라면 예를 들어와 자극. phytohaemagglutinin (PHA), 세포의 생존 후 손실 됩니다.주의: 모든 혈액과 혈액 제품의 안전과 품질 전체 과정을 통해 보장 되어야 한다. 2. 방사선 설정 참고: Caco-2 세포의 방사선은 정기적으로 다양 한 유형의 암 치료에 사용 되는 선형 가속기 Istituto 디 Ricovero e Cura Carattere Scientifico (IRCCS) 미 됩니다 (파 비아, 이탈리아)의 방사선 치료 부서에서 수행 되었다. 6 MV 피크를 광자 엑스레이 에너지를 설정 합니다. 선형 가속기 pulsing 정권에서 작동 한다 (대략 4 ms의 2 연속 펄스 사이의 시간; 5 µs 복용량에 대 한 단일 펄스의 지속 시간 최대 1 × 10-3 Gy/p 비율). Caco-2 장에 1.4 cm 두께 유리 야 (사용 된 방사선의 보다 약간 더 큰 거리에 해당) 방사선의 소스에서 100 cm에서 엑스레이의 궤도에 삽입을 포함 하는 6-잘 접시를 놓습니다. 방사선 backscattered 방사선 구성 요소 및 입자 평형 발생 하기 전에 각 샘플에 0.5 cm 두께 bolus를 놓습니다. 셀을 비추는 (2-10 Gy 사이의 복용량) 아파트와 대칭 (± 2%) 20 x 20 cm2 방사선 분야 그리고 분당 3 Gy의 복용량 비율.참고: “가짜” 제어-비친된 셀 받았다 방사선 룸을 입력 하지 않고 비친된 그들의 동일한 절차 조건 (받은 복용량: 0 Gy).주의: 이온화 방사선 생산 장치 전문된 인력에 의해서만 사용 되어야 한다. 3. 세포 생존 능력 분석 실험 (MTT 분석 결과) 참고: Caco-2 세포 대사 활동143-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 (MTT) 분석 결과 통해 평가 했다. 시드 2 × 105 Caco-2 24-잘 접시 24 h에에서 완전 한 매체의 1.25 mL에 조사 하기 전에. 2.1-2.4 단계에서 설명한 대로 셀을 비추는 다음 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 세포를 품 어. 방사선 조사, 후 21 h 5 mg/mL MTT 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 포함 된 5% CO2 3 h 습도 분위기에서 37 ° C에서 셀을 계속. 삭제는 상쾌한 고 1 mL의 PBS로 세포를 씻어. 각 잘에서 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 500 µ L을 추가 하 여 formazan 결정을 녹이 고 λ에서 다 잘 플레이트 리더 흡 광도 평가 = 570 nm. 방사선 조사 후 단계 3.3-3.4-3.5-3.6에서 45 h를 반복 합니다.참고: 결과 100%로 표준화 해당 가짜 상태에서 섭 동으로 표시 됩니다.주의: DMSO는 피부, 눈 및 호흡 체계 (GHS07, GHS08)에 대 한 가연성 및 자극 에이전트입니다. 눈 접촉, 풍부한 물으로 즉시 세척 하 고 의료 조언을 추구 합니다. MTT는 피부, 눈 및 호흡 체계 (GHS07, GHS08)에 대 한 자극 에이전트. 눈 접촉, 물로 하 고 의료 조언을 추구 합니다. 4. 가능한 셀 결정 (Trypan Blue 염료 배제 분석 결과)의 비율 참고: 실행 가능한 세포의 백분율 Trypan Blue 염료 배제 분석 결과 의해 평가 되었다. 시드 2 × 105 Caco-2 24-잘 접시 24 h에에서 완전 한 매체의 1.25 mL에 조사 하기 전에. 셀 범위 0에에서 복용량을 비추는-10 Gy (2.1-2.4 단계 참조) 다음 24-48 h에 대 한 5% CO2 를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 세포를 품 어. 2 선택한 시간 포인트, PBS로 세포 세척, 후, 삭제 다음 트립 신-ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 2 분 동안 5% CO2 를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 세포를 넣어 다음 완전 한 매체 효소 반응 체포를 추가 합니다. 1.5 mL 튜브에 세포를 수집 하 고 원심 5 분 삭제에 대 한 500 x g에 튜브는 상쾌한 다시 PBS의 50 µ L에서 세포를 일시 중지. Trypan Blue 염료 솔루션의 50 µ L로 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 실 온에서 3 분을 위한 혼합물을 품 어. 스테인드 계산 (비 가능한) 및 (가능한) 셀 Bürker 챔버와 흠 없는. 5. 트랜스 상피 전기 저항 (TEER) 씨앗 5 × 105 Caco-2 셀 6 잘 플레이트에 조사 이전 1 주일 공동 삽입 (폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물), 2 x 106 모/cm2) 문화. 1 시간 전에 방사선, 전압계/ohmmeter와 TEER를 측정 합니다. 2.1-2.4 단계에서 설명한 대로 셀을 비추는. Caco-2 셀 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 PBMC 공동 문화의 존재/부재에 품 어. 처음 몇 시간 후 방사선에 대 한 측정 TEER 매 시간, 그리고 이후에 모든 3 h 48 h까지. 6. 서쪽 오 점 분석 Claudin-1, Occludin, Afadin, 조 1, ZO-2, NF-kB, 및 XIAP 씨앗 5 × 105 셀 6 잘 플레이트 공동 문화에 엑스레이 노출 하기 전에 1 주 (애완 동물, 2 x 106 모/cm2)를 삽입 하 고 2.1-2.4 단계에서 설명한 대로 셀을 비추는. Caco-2 셀 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 PBMC 공동 문화의 존재/부재에 품 어. Caco-2를 준비 하는 방사선 조사, 후 48 h 및 PBMC 세포 lysates 셀 세포와 세포를 치료 하 여 버퍼-20 ° c.에 샘플 저장참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. Bicinchoninic 산 (BCA) 메서드에서 총 단백질 양을 계량.참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. Laemli 샘플 버퍼 β-mercaptoethanol 추가 총 단백질의 동등한 양으로 혼합 (β-mercaptoethanol의 최종 농도 5%), 5 분 동안 95 ° C에서 샘플을 열 고 10000 x g에서 그들을 회전. 부하 샘플 4-20%에서 젤 캐스트 및 polyvinildiene 불 소 (PVDF) 막에 1 h. 전송 단백질에 대 한 120 V에서 전기 영동을 수행. 잠복기 5% 비 지방 건조 우유 (NFDM) 0.2% 추가 PBS에 실 온에서 PVDF 막 여 비 특정 바인딩 사이트 차단 트윈-20 (PBT). 막 세 번 0.2%의 10 mL로 씻어 PBT 5 분. 다음 주 항 체와 4 ° C에서 하룻밤 배치 되 고 전에 실 온에서 1 h에 대 한 부드러운 동요와 막 품 어: 안티-claudin-1, 안티-ZO-1, 안티-ZO-2, 안티-afadin, 안티 occludin, 안티-NF-kB, 안티-XIAP와 안티 말라. 막 세 번 0.2%의 10 mL로 씻어 PBT 5 분. 부드러운 동요와 함께 실 온에서 1 h에 대 한 2 차 항 체 양 고추냉이 과산화 효소 HRP 활용으로 막 품 어. 막 세 번 0.2%의 10 mL로 씻어 PBT 5 분. 실내 온도에, 향상 된 화학 발광 키트와 함께 막을 배양 하 여 사진 필름을 개발 합니다. 사진 필름 스캐닝 시스템으로 취득 하 고 적당 한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 얻은 밴드 계량.참고: Claudin 1, Occludin, Afadin, ZO-1, 그리고 조 2의 평가 Caco-2 셀에서 수행 됩니다. NF-kB와 XIAP의 평가 PBMC에서 수행 됩니다.주의: β-mercaptoethanol은 독성 (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). 하지 증기를 호흡, 환경에 릴리스를 방지 하 고 개인 보호 장치 및 호흡기 보호를 착용. 삼 키는 경우 즉시 의료 조언을 부탁 드립니다. 7. 통계 분석 방사선 노출 및 공동 문화는 통계적으로 중요 한 섭 동 유발 여부를 확인 하려면 테스트를 수행 양방향 분산 분석 (ANOVA) 여러 비교 반복 측정 (비교 Bonferroni 게시물 임시 테스트와 함께 복제) 의미합니다. 명시 하지 않으면, 양측 스튜던트 t-검정에 의해 통계적 유의 성 (p)를 계산 합니다. 각 값은 ≥3 독립적인 실험 ± 표준 오차의 의미 (SEM)의 평균입니다.