ひと成人皮膚線維芽細胞から誘導される神経細胞の高収率文化の生成の単純です

成人皮膚線維芽細胞は脳修復 (ケンブリッジ、イギリス) のジョン ・ ヴァン ・ Geest センターで研究パーキンソン病やハンチントン病の診療所から得られ、ローカル倫理的な承認 (REC 09/H0311/88) の下で使用されます。皮膚生検の手順の詳細については、参照8を参照してください。 1. 皮膚線維芽細胞のプログラムし直すための準備 システムまたは 37 ° C の水浴を融解自動セルを使用して、大人のひと皮膚繊維芽細胞 (aHDFs) を解凍し、線維芽細胞培地 10 mL に T75 フラスコ (自動化された細胞カウンターの数) あたりの 200,000 のプレート (表 1参照) で 5% CO237 ° C。 次の日に線維芽細胞培地で完全な中型の変更を実行します。 線維芽細胞培地ごとに 3-4 日、電池が 95% の confluency に達するまでを変更します。注: 1 つの合流フラスコ約 1,000,000 セルが含まれます。細胞株 (セクション 2) の株式または (セクション 3) をプログラムし直すための直接再メッキの準備を構築する、aHDFs を固定できます。 2. 皮膚線維芽細胞の凍結 4 ° C で冷蔵庫、アイス ボックスに速度制御凍結コンテナーを配置します。 3-5 分の 37 ° C で 0.05% トリプシン (T75 フラスコあたり 1.5 mL) と細胞を切り離します。 線維芽細胞培地 (ウシ胎児血清 (FBS) を含む) トリプシン (T75 フラスコあたりフラッシュあたり 3 mL) を中和し、フラスコ内のセルを 2 回フラッシュで 15 mL チューブの剥離細胞を収集するを追加します。 自動化された細胞カウンターの値を使用してセルをカウントします。(推奨) の凍結バイアルあたり約 500,000 aHDFs。 5 分間 400 x g で細胞をスピンします。 凍結培地 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します (表 1参照) や極低温の管に転送。速度制御の冷凍コンテナーに直接チューブを配置します。 -80 ° c の装置を一晩凍結制御率を格納します。次の日は-140 ° C のフリーザーにチューブを転送し、必要になるまでを格納します。 3. (日 − 1) をプログラムし直すためのめっき 短期的実験 (最大 30 日) にゼラチン コーティングを使用する勧めします注意。また、長期実験のためポリ L-オルニチン、フィブロネクチン、ラミニン (PFL) コーティングを開始する勧めします。 ため、aHDFs をめっきする前に 60 分 0.1% ゼラチン (250 μ L/ウェル) で 24 ウェル プレートをコートし、37 ° c. で孵化させなさい 線維芽細胞、aHDFs 培地を吸引します。DPBS で一度洗います。3-5 分の 37 ° C で 0.05% トリプシン (T75 フラスコあたり 1.5 mL) と細胞を切り離します。 トリプシン (T75 フラスコあたりフラッシュあたり 3 mL) を中和し、フラスコ内のセルを 2 回フラッシュで 15 mL チューブの剥離細胞を収集する線維芽細胞培地を追加します。 スピン ・ ダウン 5 分破棄上清の 400 x g で細胞と線維芽細胞培地 1 mL の細胞ペレットを再懸濁します。 (染色トリパン ブルー色素の 90% 以上は細胞質の良い変換チェックできるように) 自動化された細胞カウンターを使用してセルをカウントします。 完全な 24 ウェル プレート 1,320,000 13.2 mL 中の 100,000 セル/mL の懸濁液 (または 550 μ L 必要な井戸の数を掛けた線維芽細胞培地で細胞/ウェル 55,000) を達成するために線維芽細胞中の細胞の懸濁液を準備します。 プレートからゼラチンを吸引し、DPBS で 2 回洗ってください。各ウェルに、細胞懸濁液 500 μ L を追加し、37 ° c 5% CO2で一晩インキュベートします。 4. ウイルス伝達 (0 日) 注: カテゴリ 2 装置およびウイルスを中和するためにエージェントが使用にレンチ ウイルス粒子の操作が必要です。ダブル ペア手袋の身に着けていることを強くお勧めします。 ウォーム アップ 13.2 mL 37 ° c. に線維芽細胞中の 転写因子Ascl1 Brn2 2 つ短いヘアピン Rna (shRNA) を室温で残りをターゲットを含むレンチウイルスベクターを解凍します。注:8; を参照を参照してください。プラスミドのリポジトリで利用可能です。レンチを生成する手順の詳細については9を参照を参照してください。 20 の任意の伝達の増強物のない媒体にレンチ ウイルス感染 (MOI) の多様性で aHDFs に感染するために必要な量を追加します。 線維芽細胞培レンチウイルスベクター (500 μ L/ウェル) 24 ウェル プレートの中に置き換えるし、5% CO2の 37 ° C で一晩インキュベートします。 次の日は、レンチウイルスベクターせず新鮮な線維芽細胞培地で井戸の中を置き換えます。注: 媒体は感染 7 日間と次のウイルスの伝達の最初の週の間に十分な保護と処理手順の使用など。 5. 変換細胞の維持 注: 変換が開始されるとセルが持ち上げるに敏感プレートをチップアップし、1,000 μ L ピペットを使用してデタッチ細胞を避けるためにメディアを削除するときに注意してください。 3 日目、線維芽細胞培地を取り除き、早期神経変換中を 500 μ l 添加 (表 1参照)。 週に 2 ~ 3 回は 225 の井戸から古い媒体の μ L と新鮮な初期神経変換中の追加の 250 μ L を取る。 18 日に各ウェルから媒体をすべてを削除し、後半神経変換中の 500 μ L に置き換えます (表 1参照)。 後期神経変換中と上のとして媒体の半分の 25 日目または実験エンドポイント (図 1 a) まで 2-3 日を変更していきます。注: セルは実験のためのすべてのよくないメッキパーツされた場合、は、媒体の明白な蒸発を防ぐため、井戸の間の変動を最小限に抑えるために、PBS または水で空井戸を記入します。 ストック濃度 作業濃度 線維芽細胞培地 基礎培地 N/A N/A ペニシリン/ストレプトマイシン 10,000 U/mL 100 mg/mL 政府短期証券 N/A 10% 凍結中 線維芽細胞培地 N/A 45% 政府短期証券 N/A 45% DMSO N/A 10% 初期神経変換中 (ENM) 神経分化培地 N/A N/A ペニシリン/ストレプトマイシン 10,000 U/mL 100 mg/mL CHIR99021 10 mM 2 Μ M SB 431542 20 mM 10 Μ M 酒を飲むこと 100 μ g/mL 0.5 μ g/mL LDN 1931189 10 mM 0.5 Μ M バルプロ酸 1 M 1 mM LM 22A4 20 mM 2 Μ M GDNF 20 μ G/ml 2 ng/mL NT3 10 μ G/ml 10 ng/μ l db キャンプ 50 mM 0.5 mM 後期神経変換中 (LNM) 神経分化培地 N/A N/A ペニシリン/ストレプトマイシン 10,000 U/mL 100 mg/mL LM 22A4 20 mM 2 Μ M GDNF 20 μ G/ml 2 ng/mL NT3 10 μ G/ml 10 ng/μ l db キャンプ 50 mM 0.5 mM FACS バッファー HBSS 1 x [- カルシウム、- マグネシウム – フェノールレッド] N/A N/A BSA N/A 1% DNAase N/A 0.05% 表 1: 使用異なる培地の組成します。線維芽細胞培地を含む、媒体、初期神経変換中、後期の神経変換中、FACS バッファーを凍結このプロトコルで必要なすべてのメディア構成の完全な説明。 6. ガラス Coverslips 電気生理学的記録 注: 白衣、ゴーグルを着用、手袋をダブル、ヒューム フードの仕事のすべてを完了することをお勧めします。このプロトコルは10から適応です。 重複なしのガラス皿の底にガラス coverslips を配置します。 掃除用洗剤 (約 30 mL) を振動中に危険にさらすオーバーフローなし coverslips のすべてが水没する一般的なラボを追加します。2 h の遅い速度で軌道シェーカーの上に置きます。 脱イオン水をオートクレーブで 6 回 (各 30 分) を洗ってください。 95% のエタノールの 2 h を追加します。 エタノールを取り外して coverslips が乾くまで待ちます。 一度乾燥、ガラス ビーカー、coverslips に転送し、coverslips が水中に沈むまでに 70% の硝酸を追加します。 60 分間の超音波発生装置浴にガラス ビーカーを配置します。 硝酸を取り外してオートクレーブ脱イオン水にて 3 回洗浄します。注意: は、暴力的な反応につながるよう常に酸と水、周りの他の方法ではないに追加します。 できるだけビーカーから同様に多くの水を削除し、coverslips が水中に沈む; まで濃塩酸 (塩酸) を追加ビーカーとパラフィン フィルムでカバーを旋回します。 60 分間超音波 (50-60 Hz、30 W)。 可能であり、場所として coverslips から適切なゴミ箱に限り HCI を削除します。2 回オートクレーブ脱イオン水ですすいでください。 フードから coverslips を取り出して、HCI のすべてが削除されるまで、20 回 (またはそれ以上) に脱イオン水をオートクレーブですすいでください。 一度乾燥、滅菌 24 ウェル プレート coverslips に配置。 Uv (紫外線) を受ける板を配置一晩光。次の日、coverslips を使用する準備ができています。注: ガラス coverslips が使用されている場合は、PFL コーティングを使用する推奨です。単純に (滅菌鉗子を使用して) 24 ウェル プレートの各ウェルに 1 つ coverslip を配置し、以下のプロトコルに従います。 7. PFL 長期的文化のコーティング ポリ-L-オルニチン (500 μ L/ウェル) と 24 ウェル プレートをコート、5% CO2の 37 ° C で一晩置いておきます。 ポリ L-オルニチンを吸引し、フォーム滴上十分乾燥しているまで待ちます。 ドロップ (約 60 μ L) それぞれの中心でラミニンのよくし、カバーガラスの表面全体をカバーを確認します。5% CO2の 37 ° C で 2 時間 45 分を残します。 DPBS 3 回洗います。 フィブロネクチン (500 μ L/ウェル) を追加し、37 ° c 5% CO2で一晩おきます。 セルを追加する前に DPBS で一度洗う。注: PFL コーティングは進歩的な細胞死は 30 日から予想されることですが、プラグイン (100 日以上) の長い言葉文化に使用できます。 8. FACS 注: 再 FACS 後細胞をプレートに並べ替え PFL コーティング プレート 48 h で事前準備します。細胞は伝達次以降 20 日目から神経細胞接着分子 NCAM 抗体を使用して並べ替えることができます。 1,000 μ L ピペットでメディアを削除 (細胞分離を避けるためには洗浄しないでください)。 解離エージェント (250 μ L/ウェル) セルを追加、単一セルとして細胞リフトとフロートまで 10-20 分間おきます。 この時間の間に FACS バッファーを準備します。 1,000 μ L ピペットで軽くカップを刻んだ。いくつかの塊が残っている場合はもう少し、インキュベートします。 単一細胞懸濁液を取得すると、井戸からそれを削除し、1.5 mL チューブに配置。 同じ 1.5 mL チューブに後期神経変換中と場所でうまく 2 回フラッシュします。 5 分間 400 x g でスピン ・ ダウンと上澄みを廃棄します。 FACS バッファーを 200 μ l 添加の細胞ペレットを再懸濁します。 スピン ・ ダウン 5 分 400 x g でセルと上澄みを廃棄します。 8.8、8.9 の手順を 2 回繰り返します。 1:50 15 分間氷の上の濃度でひと CD56 (NCAM) 抗体を含む FACS バッファーの 50 μ L で細胞ペレットを再懸濁します。光から保護します。 5 分間 400 x g で細胞をスピンします。 200 μ L FACS バッファーを洗浄し、5 分の 400 x g で細胞をスピンで再懸濁します。 8.13 のステップを繰り返します。 Propidium ヨウ化 (PI; 10 μ G/ml) を含む FACS バッファーの 200 μ L で再懸濁します。NCAM 正 (iNs) および PI 否定的な (ライブ) 細胞の FACS を用いたゲート NCAM 抗体または PI 染色しないコントロール サンプルの蛍光強度レベルに基づいて並べ替えます。 後期神経変換媒体を含んでいる管における NCAM の陽性細胞を収集します。 PFL コーティング皿に後期神経変換中高密度 (50,000 セル/cm2) でセル自動化された細胞カウンターと再プレートを使用してセルをカウントします。 培地の半分に実験エンドポイント (図 1 a) まで後期神経変換中週 2-3 回を変更していきます。