Количественная оценка эндогенного ауксинов и цитокининов во время Internode культуры Ipecac
Summary
Случайного побегов может быть наведено на интермодального сегменты ipecac без лечения фитогормона. Для оценки динамики фитогормона во время формирования случайного стрелять, мы измерили эндогенного ауксинов и цитокининов интермодального сегментов, LC-MS/MS.
Abstract
Формирование случайного стрелять является важным методом распространения экономически важных культур и для регенерации трансгенных растений. Фитогормона лечение требуется для индукции случайного побегов в большинстве видов. Ли случайного побеги могут быть наведено определяется баланс между ауксинов и цитокининов (CK) уровнях. Много усилий уходит в определении оптимальной концентрации и комбинации фитогормонов в каждой ткани, используется в качестве эксплантов и каждого вида растений. В ipecac однако, случайного побегов может быть наведено на интермодального сегментов в культурной среде без лечения фитогормона. Это позволяет присущие пластичности ipecac для дифференцировки клеток оцениваться. Чтобы побудить случайного стреляет в ipecac, мы культивировали интермодального сегментов при 24 ° C под 15 мкмоль m−2 s−1 света в цикле Темный свет/10-h 14-h на свободных фитогормона B5 средних затвердевших с 0,2% gellan резинки на 5 недель. Расследовать фитогормона динамика во время формирования случайного стрелять, мы измерили эндогенного индол-3-уксусной кислоты и CKs в сегментах по жидкостной хроматографии тандем масс-спектрометрии LC-MS/MS. Этот метод позволяет анализа эндогенных индол-3-уксусной кислоты и уровни CKs в простой форме. Он может применяться для изучения динамики эндогенного ауксинов и CK период органогенеза в других видов растений.
Introduction
Готлиб Иоганн Фридрих Хаберландт (1854-1945) предложил концепцию «тотипотентность», по которой завод клетки можно разделить, дифференцировать и регенерации целых заводов даже после их предварительного дифференциации в типы конкретных клеток в зрелых растений1. В культуре ткани ли регенерации растений может быть наведено или не определяется сочетание и концентрации экзогенно прикладной фитогормонов в среднего роста. Скуг и Миллер обнаружил, что случайного побеги могут быть вызваны из табака каллуса на питательной среды, содержащие высокий коэффициент CKs в ауксины, тогда как придаточных корней может быть наведено на носителе, содержащих низкий коэффициент2. После этого вывода, тканевой культуры широко используется для распространения экономически важных культур и для регенерации трансгенных растений3. Случайного побегов может быть вызван из тканей помимо стрелять апикальной Меристемы, например, листья, корни и междоузлий. Фитогормона лечение требуется для индукции случайного побегов в большинстве видов растений. Однако оптимальной концентрации и комбинации отличаются по видам и среди тканей, используемых в качестве эксплантов. Таким образом много усилий уходит в определении оптимальной концентрации и комбинации фитогормонов для экспериментов.
Ипекакуана (Brot.) L. Андерссон (ipecac) это лекарственное растение, содержит алкалоиды, как эметин и cephaeline, главным образом в корни4. Экстракты корня используются как отхаркивающее, рвотное и amoebicide5. Хотя ipecac Естественно произрастает в тропических лесах Бразилии, он неохотно установить семена в культуре, и всхожесть снижается во время хранения семян в Японии, с ее холоднее климат6. Вместо этого он распространяется на культуре ткани, в которой случайного стрелять формирование на междоузлий является наиболее эффективным методом7,8. Интересно, что в этот вид без фитогормона лечения8может быть наведено случайного побегов.
Случайного побеги образуются на эпидермис в регионе апикальной интермодального сегментов без callusing, но не в базальной области9. Эта разница указывает ткани полярности в интермодального сегментов, который, вероятно, под фитогормональный регулирования. Ipecac культуры система позволяет уникальная возможность анализировать изменения уровня эндогенного фитогормона во время формирования случайного стрелять. Здесь мы представляем наш метод для анализа эндогенными уровнями одного ауксинов (индол-3-уксусной кислоты (IAA)) и четыре CKs (изопентенил аденин (iP), изопентенил riboside аденин (ПИС), транс-Зеатин (tZ) и транс-Зеатин riboside (ТЗР)) в интермодального сегментов с помощью LC-MS/MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы определить распределение фитогормонов участвующих в органогенез, важно использовать растительные материалы, в которых органогенеза можно наблюдать на фитогормона свободной среде, потому что когда фитогормонов экзогенно применяются к эксплантов для стимулирования побеги и ко?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны г-н Акира Мураками кафедры прикладной Biosciences, Университета Тойо и г-н Koudai Танигути Гумма центра сельскохозяйственной технологии для их технической помощи. Мы признательны также профессором Shosaku Kashiwada и доктор Uma Елена Раджагопалан, Университетом Тойо за их предложения. Это исследование было поддержано в части научно-исследовательский центр для жизни и экологических наук, Университет Тойо.
Materials
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13×100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N., Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. . Transgenic plants and crops. , 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C., Atal, C. K., Kapur, B. M. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. , 295-301 (1982).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K., Bajaj, Y. P. S. . Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
