Quantificação de auxina endógena e citocinina durante Internode cultura de ipeca
Summary
Brotos adventícios podem ser induzidos em segmentos internodal de ipeca sem tratamento phytohormone. Para avaliar a dinâmica phytohormone durante formação de tiro acidental, medimos endógena auxina e citocinina em segmentos internodal por LC-MS/MS.
Abstract
Formação de tiro acidental é uma técnica importante para a propagação de culturas economicamente importantes e a regeneração de plantas transgênicas. Tratamento de phytohormone é necessário para a indução de brotos adventícios na maioria das espécies. Se os brotos adventícios podem ser induzidos é determinado pelo saldo entre a auxina e citocinina (CK) níveis. Muito esforço vai para determinar concentrações óptimas e combinações de fitohormônios em cada tecido usado como explantes e em cada espécie de planta. Em ipecac, no entanto, brotos adventícios podem ser induzidos em segmentos internodal em meio de cultura sem tratamento phytohormone. Isso permite que a plasticidade inerente de ipeca para diferenciação de célula a ser avaliada. Para induzir os brotos adventícios em ipecac, nós cultivadas internodal segmentos a 24 ° C sob 15 µmol m− 2 s− 1 de luz em um ciclo escuro da luz/10-h 14-h phytohormone livre B5 meio solidificado com 0,2% gelano por 5 semanas. Para investigar a dinâmica phytohormone durante formação de tiro acidental, medimos endógeno ácido indol-3-acético e CKs nos segmentos por líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia de LC-MS/MS. Este método permite a análise de ácido indol-3-acético endógeno e CKs níveis de forma simples. Pode ser aplicado para investigar a dinâmica de auxina endógena e CK durante a organogênese em outras espécies de plantas.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) propôs o conceito de “totipotência”, pela qual planta células podem dividir, diferenciar e regenerar plantas inteiras mesmo após sua prévia diferenciação em tipos de células específicas em plantas maduras1. Em cultura de tecidos, se planta regeneração pode ser induzida ou não é determinada pela combinação e concentração de fitohormônios exogenamente aplicadas no meio de crescimento. Skoog e Miller encontraram que brotos adventícios poderiam ser induzidos de tabaco calo no meio de cultura contendo uma alta proporção de CKs de auxinas, Considerando que raízes adventícias poderiam ser induzidas em meio contendo uma baixa relação2. Desde essa constatação, cultura de tecidos foi amplamente utilizada para a propagação de culturas economicamente importantes e a regeneração de plantas transgénicas3. Brotos adventícios podem ser induzidos a partir de tecidos que não sejam o meristema apical de tiro, como folhas, raízes e entrenós. Tratamento de phytohormone é necessário para a indução de brotos adventícios na maioria das espécies de plantas. No entanto, o ideais concentrações e combinações diferem por espécie e entre tecidos utilizados como explantes. Assim, muito esforço vai para determinação da concentração ideal e combinações de fitohormônios para experimentos.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecacuanha) é uma planta medicinal que contém alcaloides como Emetina e a Cefalina, principalmente no raízes4. Extratos de raiz são usados como um expectorante, um emético e um amoebicide5. Embora ipecac cresce naturalmente nas florestas tropicais do Brasil, é relutante em conjunto de sementes na cultura, e a taxa de germinação diminui durante o armazenamento de sementes no Japão, com seus de clima mais frio6. Em vez disso, ele é propagado por cultura de tecidos, no qual adventícios atirar formação em entrenós é o mais eficiente método de7,8. Curiosamente, os brotos adventícios podem ser induzidos nesta espécie sem phytohormone tratamento8.
Brotos adventícios são formados na epiderme na região apical dos segmentos internodal sem callusing, mas não na região basal9. Esta diferença indica a polaridade do tecido em segmentos internodal, que é, provavelmente, ao abrigo do Regulamento fitohormonal. O sistema de cultura de ipecac permite uma oportunidade única para analisar as alterações nos níveis endógenos phytohormone durante formação de tiro acidental. Aqui apresentamos nosso método para a análise dos níveis endógenos de uma auxina (ácido indol-3-acético (IAA)) e quatro CKs (isopentenilo adenina (iP), Ribosídica de adenina de isopentenilo (iPR), trans-Zeatina (tZ) e trans-Zeatina Ribosídica (tZR)) em segmentos internodal através do uso de LC-MS/MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para identificar a distribuição dos fitohormônios envolvidos na organogênese, é importante o uso de materiais vegetais em que organogênese pode ser observado na média phytohormone-livre, porque quando os fitohormônios são exogenamente aplicados a explantes para induzir brotos ou raízes, elas afetam o explante todo, tornando-se difícil avaliar a plasticidade inerente de plantas na diferenciação celular e organogênese. Brotos adventícios podem ser induzidos em meios de cultura livre phytohormone em outras es…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nós estamos gratos ao Sr. Akira Murakami do departamento de Biociências aplicadas, Universidade de Toyo e Sr. Koudai Taniguchi do centro de tecnologia agrícola de Gunma para sua assistência técnica. Nós também estamos gratos ao Professor Shosaku Kashiwada e Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Universidade Toyo para suas sugestões. Este estudo foi suportado em parte pelo centro de pesquisa para a vida e ciências ambientais, Universidade de Toyo.
Materials
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13×100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
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