Quantificazione di endogeno dell'auxina e citochinina durante la coltura di internodo di Ipecac
Summary
Germogli avventizi possono essere indotta su segmenti internodale di ipecac senza trattamento di fitormoni. Per valutare la dinamica di fitormoni durante la formazione di sparo accidentale, abbiamo misurato endogeno dell’auxina e citochinina in segmenti internodale mediante LC-MS/MS.
Abstract
Formazione di sparo accidentale è una tecnica importante per la propagazione delle colture economicamente importanti e per la rigenerazione di piante transgeniche. Trattamento di fitormoni è necessaria per l’induzione di germogli avventizi in maggior parte delle specie. Se possono essere indotta germogli avventizi è determinata dall’equilibrio tra auxine e citochinine (CK) livelli. Molto sforzo va a determinare le concentrazioni ottimale e combinazioni di fitormoni in ogni tessuto utilizzato come espianti e in ogni specie di pianta. In ipecac, tuttavia, germogli avventizi possono essere indotto sui segmenti internodale in terreno di coltura senza trattamento di fitormoni. Questo consente la plasticità intrinseca di ipecac per differenziazione delle cellule deve essere valutata. Per indurre i germogli avventizi in ipecac, abbiamo coltivato internodale segmenti a 24 ° C sotto 15 µmol m− 2 s− 1 di luce in un ciclo di buio luce/10-h 14-h il medium di B5 senza fitormoni solidificato con gomma di gellan 0,2% per 5 settimane. Per studiare dinamiche di fitormoni durante la formazione di sparo accidentale, abbiamo misurato acido di indole-3-acetic endogeno e CKs nei segmenti di liquida cromatografia-spettrometria di massa LC-MS/MS. Questo metodo permette l’analisi di acido di indole-3-acetic endogeno e livelli di CKs in modo semplice. Può essere applicato per studiare le dinamiche di auxina endogena e CK durante l’organogenesi in altre specie vegetali.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) ha proposto il concetto di “totipotenza”, da quale pianta cellule possono dividere, differenziare e rigenerare le piante intere anche dopo la loro prima differenziazione in tipi cellulari specifici in piante mature1. Nella coltura del tessuto, se pianta rigenerazione può essere indotta o non è determinata dalla combinazione e concentrazione di fitormoni esogenicamente applicate nel mezzo di crescita. Skoog e Miller trovato che germogli avventizi potrebbero essere indotto dal callo di tabacco su terreno di coltura contenente un alto rapporto di CKs di auxine, mentre radici avventizie potrebbero essere indotto su terreno contenente un rapporto basso2. Da tale constatazione, la coltura del tessuto è stato ampiamente utilizzata per la propagazione delle colture economicamente importanti e per la rigenerazione di piante transgeniche3. Germogli avventizi possono essere indotta da tessuti diversi meristema apicale di sparare, come foglie, radici e internodi. Trattamento di fitormoni è necessaria per l’induzione di germogli avventizi nella maggior parte delle specie di piante. Tuttavia, le concentrazioni ottimale e combinazioni differiscono da specie e tra tessuti utilizzati come espianti. Così, molto sforzo va a determinare le concentrazioni ottimale e le combinazioni di fitormoni per esperimenti.
Psychotria ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (ipecac) è una pianta medicinale che contiene alcaloidi come la emetine e Cefelina, principalmente in radici4. Gli estratti della radice sono utilizzati come espettorante, emetico e un amoebicide5. Anche se ipecacuana cresce spontaneamente nelle foreste pluviali tropicali del Brasile, è riluttante a impostare semi nella cultura, e il tasso di germinazione diminuisce durante la conservazione del seme in Giappone, con il clima più freddo6. Invece, si propaga dalla coltura del tessuto, in cui avventizi spara formazione su internodi è il più efficiente metodo7,8. Interessante, i germogli avventizi possono essere indotta in questa specie senza fitormoni trattamento8.
Germogli avventizi si formano sull’epidermide della regione apicale della internodale segmenti senza forzatura, ma non nella regione basale9. Questa differenza indica la polarità di tessuto nei segmenti internodale, che è probabilmente ai sensi del regolamento phytohormonal. Il sistema di cultura ipecacuana permette un’occasione unica per analizzare i cambiamenti nei livelli endogeni fitormoni durante la formazione di sparo accidentale. Qui vi presentiamo il nostro metodo per l’analisi dei livelli endogeni di uno auxina (acido indolo-3-acetico (IAA)) e quattro CKs (isopentenyl adenina (iP), isopentenyl adenina riboside (iPR), trans-zeatina (tZ) e trans-zeatin riboside (tZR)) nei segmenti internodale attraverso l’uso di LC-MS/MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per identificare la distribuzione dei fitormoni coinvolti nell’organogenesi, è importante utilizzare materiali vegetali in cui organogenesi può essere osservato su medium senza fitormoni, poiché quando fitormoni esogenicamente vengono applicati agli espianti per l’induzione germogli o radici, colpiscono l’espianto intero, rendendo difficile valutare la plasticità intrinseca delle piante nella differenziazione cellulare e l’organogenesi. Germogli avventizi possono essere indotta su terreni di coltura privo di fitormon…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Siamo grati al signor Akira Murakami del dipartimento di scienze biologiche applicate, Università Toyo e signor Koudai Taniguchi del Gunma Agricultural Technology Center per la loro assistenza tecnica. Siamo anche grati al Professor Shosaku Kashiwada e Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo University per i loro suggerimenti. Questo studio è stato sostenuto in parte dal centro di ricerca per la vita e scienze ambientali, Università Toyo.
Materials
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13×100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N., Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. . Transgenic plants and crops. , 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C., Atal, C. K., Kapur, B. M. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. , 295-301 (1982).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K., Bajaj, Y. P. S. . Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
