כימות של אוקסין אנדוגני, ציטוקינין במהלך Internode תרבות הוזמנתי למסיבה
Summary
נצרי adventitious יכולה להיגרם במקטעים internodal הוזמנתי למסיבה ללא טיפול phytohormone. כדי להעריך את הדינמיקה phytohormone במהלך היווצרות לירות adventitious, מדדנו אוקסין אנדוגני, ציטוקינין בקטעים internodal על-ידי LC-MS/MS.
Abstract
לירות adventitious צורה היא טכניקה חשוב התפשטות של הגידולים החקלאיים כלכלית ועל לרגנרציה של הצמחים הטרנסגניים. Phytohormone טיפול נדרש אינדוקציה של נצרי adventitious של רוב המינים. אם יורה adventitious יכולה להיגרם נקבעת על-ידי האיזון בין אוקסין ציטוקינין (CK) רמות. מאמץ רב נכנס לקביעת ריכוזים מיטביים ושילובים של phytohormones כל רקמה משמש explants, כל מיני צמחים. ב. הוא אדם חכם, עם זאת, יורה adventitious יכולה להיגרם במקטעים internodal תרבות בינוני ללא טיפול phytohormone. פעולה זו מאפשרת את פלסטיות הגלום הוזמנתי למסיבה עבור תאית התמיינות להערכה. לזירוז יורה adventitious, הוזמנתי למסיבה, אנחנו תרבותי מקטעים internodal ב 24 ° C תחת 15 µmol מ’−2 s− 1 של אור במחזור 14-h אור/10-h כהה. ללא phytohormone B5 בינוני פני השטח למוצק עם מסטיק gellan 0.2% למשך 5 שבועות. לחקור phytohormone dynamics במהלך היווצרות לירות adventitious, מדדנו אנדוגני חומצה אינדול-3-אצטית ואת הגרביים בתוך המקטעים באמצעות ספקטרומטר מסה טנדם-כרומטוגרפיה נוזלית LC-MS/MS. שיטה זו מאפשרת ניתוח של חומצה אינדול-3-אצטית אנדוגני ורמות הגרביים בדרך פשוטה. ניתן להחיל אותה לחקור את הדינמיקה של אוקסין אנדוגני, CK במהלך organogenesis של מיני צמחים אחרים.
Introduction
Haberlandt גוטליב (1854-1945) הציע את הרעיון של “totipotency”, על ידי הצמח אילו תאים יכולים לחלק, להבדיל, והפק צמחים שלמים גם לאחר בידול מוקדמת שלהם לתוך תאים מסוים סוגי שתילים בוגרים1. בתרבות רקמה, אם התחדשות הצמח יכולה להיגרם או לא נקבעת על ידי שילוב של ריכוז phytohormones exogenously יישומית במצע הגידול. Skoog ומילר מצא כי נצרי adventitious יכולים להיגרם מן קסם טבק באמצעי תרבות המכיל יחס גבוה של הגרביים כדי auxins, ואילו שורשים adventitious יכולים להיגרם על בינוני המכיל יחס נמוך2. מאז הממצאים, תרביות רקמה כבר בשימוש נרחב על התפשטות של הגידולים החקלאיים כלכלית ועל לרגנרציה של הצמחים הטרנסגניים3. נצרי adventitious יכולה להיגרם רקמות חוץ meristem apical לירות, כגון עלים, שורשים, פרקי הגבעולים. Phytohormone טיפול נדרש אינדוקציה של נצרי adventitious של רוב מיני צמחים. עם זאת, ריכוז אופטימלי ושילובים שונים על ידי מינים ובקרב רקמות משמש explants. כך, מאמץ רב נכנס לקביעת ריכוזים מיטביים של שילובים של phytohormones לניסויים.
Carapichea ipecacuanha (ברוט.) ל’ אנדרסון (איפקאק) הוא צמח מרפא המכיל אלקלואידים כגון emetine ו- cephaeline, ובעיקר השורשים4. תמציות בסיס משמשים ומכייח, של כל ו של amoebicide5. למרות איפקאק גדל באופן טבעי הגשם הטרופיים של ברזיל, זה מסרבים להגדיר זרעים בתרבות, מקטינה שיעור הנביטה במהלך האחסון זרע ביפן, עם אקלים קר שלה6. במקום זאת, זה הופץ על ידי תרביות רקמה, אשר adventitious לירות7,השיטה היעילה ביותר8הוא היווצרות על פרקי הגבעולים. מעניין, יורה adventitious יכולה להיגרם במין זה ללא טיפול phytohormone8.
נצרי adventitious נוצרות על האפידרמיס באזור הפסגה של מקטעי internodal ללא callusing, אך לא את הבסיס באזור9. הבדל זה מציין קוטביות רקמות בקטעים internodal, שהוא כנראה לפי תקנה phytohormonal. מערכת התרבות איפקאק מאפשר הזדמנות ייחודית לנתח את השינויים ברמות phytohormone אנדוגני במהלך היווצרות לירות adventitious. כאן אנו מציגים שלנו שיטה לניתוח של רמות אנדוגני של אחד אוקסין (חומצה אינדול-3-אצטית (רשות העתיקות)) ואת הגרביים ארבע (isopentenyl אדנין (iP), isopentenyl אדנין riboside (ריבית), טרנס-zeatin (ט ז), טרנס-zeatin riboside (תצרוכת)) בקטעים internodal באמצעות LC-MS/MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
כדי לזהות את ההפצה של phytohormones מעורב organogenesis, חשוב להשתמש בחומרים המפעל שבו organogenesis יכול להיות שנצפו על ללא phytohormone בינוני, כי כאשר phytohormones exogenously חלות explants להשראת יורה או שורשים, הם משפיעים על כל explant, ולכן קשה להעריך את פלסטיות הטבועה של צמחים תאית התמיינות, organogenesis. נצרי adventitious יכולה להיגרם על…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנחנו אסירי תודה למורקאמי אקירה מר המחלקה של החיים יישומית באוניברסיטה Toyo, מר Koudai Taniguchi של מרכז טכנולוגיה לחקלאות גאנמה לסיוע טכני שלהם אנו אסירי תודה גם פרופסור Shosaku Kashiwada של ד ר Uma Maheswari מאיה לרר, Toyo האוניברסיטה לקבלת הצעות שלהם. מחקר זה נתמך בחלקה על ידי המרכז לחקר החיים, מדעי הסביבה, אוניברסיטת Toyo.
Materials
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13×100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N., Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. . Transgenic plants and crops. , 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C., Atal, C. K., Kapur, B. M. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. , 295-301 (1982).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K., Bajaj, Y. P. S. . Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
