Kwantificering van endogene auxine en cytokinine tijdens stengellid cultuur van Ipecac
Summary
Onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt op overslagfaciliteiten segmenten van ipecac zonder phytohormone behandeling. Om te beoordelen phytohormone dynamiek tijdens onvoorziene schieten vorming, we gemeten endogene auxine en cytokinine in overslagfaciliteiten segmenten door LC-MS/MS.
Abstract
Onvoorziene schieten formatie is een belangrijke techniek voor de verspreiding van economisch belangrijke gewassen en voor de regeneratie van transgene planten. Phytohormone behandeling is vereist voor de inductie van onvoorziene scheuten in de meeste soorten. Of onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt wordt bepaald door het evenwicht tussen auxine en cytokinine (CK) niveaus. Veel moeite gaat in het bepalen van de optimale concentraties en combinaties van fytohormonen in elk weefsel gebruikt als explantaten en bij elke plantensoorten. In Braakwortel, kunnen echter onvoorziene scheuten worden opgewekt op overslagfaciliteiten segmenten in een kweekvloeistof zonder phytohormone behandeling. Hierdoor is de inherente plasticiteit van ipecac voor celdifferentiatie worden geëvalueerd. Om onvoorziene scheuten in Braakwortel, gekweekt we overslagfaciliteiten segmenten bij 24 ° C onder de 15 µmol m−2 s−1 van licht in een donkere cyclus van 14-h licht/10-h op phytohormone-gratis B5 medium voor 5 weken met 0,2% gellan tandvlees verhard. Om te onderzoeken phytohormone dynamiek tijdens onvoorziene schieten vorming, we gemeten endogene indool-3-azijnzuur en CKs in de segmenten door vloeibare chromatografie-tandem massaspectrometrie LC-MS/MS. Met deze methode kunt analyse van endogene indool-3-azijnzuur en CKs niveaus op een eenvoudige manier. Het kan worden toegepast om te onderzoeken van de dynamiek van endogene auxine en CK tijdens organogenese bij andere plantensoorten.
Introduction
Gottlieb Haberlandt (1854-1945) voorgesteld het concept van “totipotent”, door welke plant kunnen cellen verdelen, differentiëren en regenereren van hele planten zelfs na hun voorafgaande differentiatie in specifieke celtypes in volwassen planten1. In de weefselkweek, wordt of plant regeneratie kan worden opgewekt, of niet bepaald door de combinatie en de concentratie van exogenously toegepaste fytohormonen in het groeimedium. Skoog en Miller gevonden dat onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt uit tabak eelt op kweekmedium dat een hoge verhouding van CKs tot auxines, overwegende dat de bijwortels kon worden geïnduceerd op medium met een lage verhouding2. Sinds dat zoeken, is weefselkweek wijd verbeid gebruikt voor de verspreiding van economisch belangrijke gewassen en voor de regeneratie van transgene planten3. Onvoorziene scheuten kunnen worden opgewekt uit weefsels dan schieten apicale meristeem, zoals bladeren, wortels en groeispurt. Phytohormone behandeling is vereist voor de inductie van onvoorziene scheuten in meeste plantensoorten. Echter, de optimale concentratie en de combinaties verschillen per soort en onder weefsels als explantaten gebruikt. Dus, veel moeite gaat in het bepalen van de optimale concentraties en combinaties van fytohormonen voor experimenten.
Carapichea ipecacuanha (Brot.) L. Andersson (Braakwortel) is een medicinale plant die alkaloïden zoals emetine en Phosphatidylethanolamine, vooral in de wortels4 bevat. Root extracten worden gebruikt als een braakmiddel, een slijmoplossend en een amoebicide5. Hoewel Braakwortel natuurlijk in de tropische regenwouden van Brazilië groeit, het is terughoudend om zaden in cultuur, en de kiemkracht tarief vermindert tijdens de opslag van het zaad in Japan, met haar kouder klimaat6. In plaats daarvan, het is vermeerderd door weefselkweek, in die onvoorziene schieten formatie op de groeispurt is de meest efficiënte methode7,8. Interessant, kunnen onvoorziene scheuten worden opgewekt in deze soort zonder phytohormone behandeling8.
Onvoorziene scheuten worden gevormd op de epidermis in de apicale regio van overslagfaciliteiten segmenten zonder callusing, maar niet in de basale regio9. Dit verschil geeft aan weefsel polariteit in overslagfaciliteiten segmenten, die waarschijnlijk is onder phytohormonal verordening. De Braakwortel cultuur systeem maakt het mogelijk een unieke gelegenheid om veranderingen in de endogene phytohormone analyseren tijdens onvoorziene schieten vorming. Hier introduceren wij onze werkwijze voor de analyse van de endogene niveaus van één auxine (indool-3-azijnzuur (IAA)) en vier CKs (isopentenyl adenine (iP), isopentenyl adenine riboside (iPR), trans-Zeatine (tZ), en trans-Zeatine riboside (tZR)) in overslagfaciliteiten segmenten met behulp van LC-MS/MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ter identificatie van de verdeling van fytohormonen betrokken is in de organogenese, het is belangrijk om het gebruik van plantaardig materiaal waarin organogenese kan worden waargenomen op de drager van de phytohormone-vrij, omdat wanneer fytohormonen exogenously worden toegepast op explantaten voor inducerende scheuten of wortels, beïnvloeden ze de hele explant, waardoor het moeilijk is om te evalueren van de inherente plasticiteit van planten in de celdifferentiatie en organogenese. Onvoorziene scheuten kunnen worden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij zijn dankbaar aan Mr. Akira Murakami van de Vakgroep Toegepaste biowetenschappen, Toyo Universiteit en Mr. Koudai Taniguchi van het Gunma Agricultural Technology Center voor hun technische bijstand. Wij zijn ook dank aan Professor Shosaku Kashiwada en Dr. Uma Maheswari Rajagopalan, Toyo Universiteit voor hun suggesties. Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door het Research Center for Life en milieuwetenschappen, Toyo Universiteit.
Materials
| [2H5]indole-3-acetic acid | Olchemlm Ltd | 031 1531 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin | Olchemlm Ltd | 030 0301 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H5]trans-zeatin riboside | Olchemlm Ltd | 030 0311 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenine | Olchemlm Ltd | 030 0161 | Internal standard for LC-MS/MS |
| [2H6]N6-isopentenyl adenosine | Olchemlm Ltd | 030 0171 | Internal standard for LC-MS/MS |
| indole-3-acetic acid | Wako | 098 00181 | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin | SIGMA-ALDRICH | Z0876 5MG | standard for LC-MS/MS |
| trans-zeatin riboside | Wako | 262 01081 | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenine | SIGMA-ALDRICH | D7674 1G | standard for LC-MS/MS |
| N6-isopentenyl adenosine | ACROS ORGANICS | 22648 1000 | standard for LC-MS/MS |
| acetonitrile hypergrade for LC-MS LiChrosolv | MERCK | 1.00029.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| Water for chromatography LiChrosolv | MERCK | 1.15333.1000 | solvent for LC-MS/MS |
| HPLC | SHIMADZU | Prominence | |
| MS | Sciex | 3200QTRAP | |
| Oasis HLB 30 mg/1 cc | Waters | WAT094225 | cartridge column |
| Oasis MCX 30 mg/1 cc | Waters | 186000252 | cartridge column |
| screw neck total recovery vial | Waters | 186002805 | |
| blue, 12 x 32mm screw neck cap and PTFE/silicone septum | Waters | 186000274 | |
| Acquity UPLC BEH C18, 2.1×100 mm | Waters | 186002350 | UPLC column |
| Proshell 120 EC-C18, 2.1×50 mm | Agilent | 699775-902 | UPLC column |
| Digital microscope | Leica | DHS1000 | |
| TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
| Surgical blade | Feather | No. 22 | |
| Scalpel handle | Feather | No. 4 | |
| Savant SpeedVac/Refregerated vapor trap | Thermo Fisher Scientific | SPD111/RVT4104 | vacuum concentrartor |
| Disposable glass tobe (13×100 mm) | IWAKI | 9832-1310 | |
| Sterile petri dish | INA OPTICA | I-90-20 |
References
- Haberlandt, G. Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Math.-Naturwiss. Kl. Akad. Wiss. Wien. 111, 69-92 (1902).
- Skoog, F., Miller, C. O. Chemical regulation of growth and organ formation in plant tissues cultured in vitro. Symp Soc Exp Biol. 11, 118-130 (1957).
- Ganeshan, S., Caswell, K. L., Kartha, K. K., Chibbar, R. N., Khachatourians, G. G., McHughen, A., Scorza, R., Nip, W. K. . Transgenic plants and crops. , 69-84 (2002).
- Teshima, D., Ikeda, K., Satake, M., Aoyama, T., Shimomura, K. Production of emetic alkaloid by in vitro culture of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 278-280 (1988).
- Chatterjee, S. K., Nandi, R. P., Ghosh, N. C., Atal, C. K., Kapur, B. M. Cultivation and utilixzation of medicinal plants. Regional Research Laboratory, Council of Scientific and Industrial Research. , 295-301 (1982).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K., Bajaj, Y. P. S. . Biotechnology in Agriculture and Forestry 21, Medicinal and Aromatic Plants IV. , 87-103 (1993).
- Ideda, K., Teshima, D., Aoyama, T., Satake, M., Shimomura, K. Clonal propagation of Cephaelis ipecacuanha. Plant Cell Rep. 7 (4), 288-291 (1988).
- Yoshimatsu, K., Shimomura, K. Efficient shoot formation on internodal segments and alkaloid formation in the regenerates of Cephaelis ipecacuanha A. Richard. Plant Cell Rep. 9 (10), 567-570 (1991).
- Koike, I., Taniguchi, K., Shimomura, K., Umehara, M. Dynamics of endogenous indole-3-acetic acid and cytokinins during adventitious shoot formation in ipecac. J. Plant Growth Regul. , (2017).
- Gamborg, O. L., Miller, R. A., Ojima, K. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res. 50 (1), 151-158 (1968).
- Watad, A. A., et al. Adventitious shoot formation from carnation stem segments: a comparison of different culture procedures. Scientia Hortic. 65 (4), 313-320 (1996).
- Ajithkumar, D., Seeni, S. Rapid clonal multiplication through in vitro axillary shoot proliferation of Aegle marmelos (L.) Corr., a medicinal tree. Plant Cell Rep. 17 (5), 422-426 (1998).
- Tiwari, V., Tiwari, K. N., Singh, B. D. Comparative studies of cytokinins on in vitro propagation of Bacopa monniera. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 66 (1), 9-16 (2001).
- Rao, M. S., Purohit, S. D. In vitro shoot bud differentiation and plantlet regeneration in Celastrus paniculatus Willd. Biol. Plant. 50 (4), 501-506 (2006).
- Sanikhani, M., Frello, S., Serek, M. TDZ induces shoot regeneration in various Kalanchoë blossfeldiana Poelln cultivars in the absence of auxin. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 85 (1), 75-82 (2006).
- Yoshimoto, K., et al. Autophagy negatively regulates cell death by controlling NPR1-dependent salicylic acid signaling during senescence and the innate immune response in Arabidopsis. Plant Cell. 21 (9), 2914-2927 (2009).
- Schaller, G. E., Bishopp, A., Kieber, J. J. The yin-yang of hormones: cytokinin and auxin interactions in plant development. Plant Cell. 27 (1), 44-63 (2015).
