JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
русский

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Environment

На месте молекулярной обнаружение почвообитающих фитопатогенов, используя систему портативный ПЦР в реальном времени

Published: February 23, 2018
doi:
10.3791/56891
, , , , , ,
1Department of Plant Pathology,Washington State University, 2Parma Research and Extension Center,University of Idaho

Summary

Быстрого и точного обнаружения патогенов растений на местах, особенно почвообитающих патогенных микроорганизмов, имеет решающее значение для предотвращения дальнейшего производства посевным материалом и распространения заболеваний растений в поле. Разработанный метод здесь, с помощью портативной системы обнаружения ПЦР в реальном времени позволяет на месте диагноз в полевых условиях.

Abstract

На месте диагноз заболеваний растений может быть полезным инструментом для производителей для своевременного принятия решений, включение ранее осуществления стратегий управления болезней, которые уменьшают воздействие этой болезни. В настоящее время во многих диагностических лабораториях, полимеразной цепной реакции (ПЦР), особенно в реальном масштабе времени PCR, считается наиболее чувствительным и точным методом для обнаружения патогенов растений. Однако на основе лабораторные PCR обычно требуют дорогих лабораторного оборудования и квалифицированного персонала. В этом исследовании почву патогенов картофеля используются для демонстрации возможности для занятия молекулярных обнаружения. Это было достигнуто, используя быстрый и простой протокол, включающий добычи магнитный шарик на основе нуклеиновых кислот, портативные ПЦР в реальном времени (fluorogenic на основе выборки проба). Портативный реального времени PCR подход выгодно по сравнению с всего лишь 100 копий ДНК из системы на базе лаборатории, обнаружения Spongospora subterranea. Портативный реального времени метод ПЦР разработанных здесь может служить альтернативой подходы на основе лабораторных и полезным инструментом на месте для диагностики патогенов.

Introduction

Точного и быстрого выявления причинных патогенов значительно влияет на решения, касающиеся управления болезней растений. Почвы-болезней особенно трудно диагностировать, потому что окружающей среде почвы очень велика по отношению к заводе массы и сложным, что делает его трудно понять все аспекты заболеваний, передающихся через почву. Кроме того почвообитающих заболевания могут быть бессимптомная во время ранних стадиях инфекции, зависит от экологических стрессоров, а некоторые имеют длительного латентного, которые приводят к задержки диагноз1. Многие почву патогенов разработали выживания структуры, такие как специализированные споры или melanized гифы, на которых можно выжить в почве на протяжении многих лет даже в отсутствие их узлов. Используемые подходы для болезней, передающихся через почву управления включают в себя: избежать известных зараженных полей, используя патогеном бесплатно сертифицированные семена и саженцы, сохраняя оборудования санитарных и ограничение движения почвы и воды, когда это возможно. Знание присутствия возбудителя через стратегии молекулярной обнаружения могут также играть полезную роль, информируя своевременные решения относительно лечения ранней стадии или предварительно растений оценки полей. На месте тестирования обеспечивает дополнительные преимущества обеспечивая быстрый результат без отправки образца диагностическая лаборатория что возможно некоторое расстояние от отеля, а также могут участвовать садовод если такой диагностики выполняются «стороне поля» в их присутствии.

Для занятия диагноз, основанный на молекулярных обнаружения, чувствительность, специфичность, надежность (повторяемость и воспроизводимость) и эффективности (т.е., простота и производительность) являются важнейшими факторами для рассмотрения. Боковой поток устройства (LFDs) как Immunostrip и PocketDiagnostic, популярные методы обнаружения возбудителя на месте из-за их простоты как одношаговый пробирного. Однако LFDs не может быть право диагностический инструмент во всех ситуациях, потому что они не имеют чувствительность и специфичность и иногда дает неоднозначные результаты, если целевой возбудителя в низких концентрациях и может cross-react с аналогичных видов или родов 2. цикл опосредованной изотермической амплификация (лампа) применяется также для обнаружения на месте возбудителя и особенно недорогой благодаря лоу кост реагентов, условий реакции, которые остаются постоянными и простой колориметрические визуального анализа. Однако как LFDs, так и лампы обычно используются качественно, хотя оба подхода могут использоваться количественно с более дорогих оборудования3. Полимеразной цепной реакции (ПЦР) предлагает высокую специфичность, высокая чувствительность и количественного потенциала по сравнению с вышеупомянутыми методами обнаружения. Однако обычные технологии на базе лаборатории ПЦР требует дорогих лабораторного оборудования и квалифицированного персонала, который является основным недостатком в принятии этой технологии как метод обнаружения для целей занятия.

В этом протоколе продемонстрировал на месте диагностический метод, с помощью инструмента портативный ПЦР в реальном времени. Реальном масштабе времени PCR технология дает преимущества перед другими методами с точки зрения количественных точность, чувствительность и универсальность и широко используется для обнаружения широкого круга растения патогенов4,5, включая различные картофельных патогенов в почве6. Из-за последних тенденций рынка быстро растущих, конкурентоспособной оборудования для ПЦР технологии продолжает развиваться, чтобы быть более компактной и менее дорогим7. Протокол состоит из следующих шагов: извлечение магнитный шарик на основе нуклеиновых кислот, портативные ПЦР в реальном времени (fluorogenic на основе проб пробы) и анализа количественных данных, которые можно все сделать удаленно, используя портативный компьютер (Рисунок 1).

С помощью переносных протокол постановки ПЦР разработан здесь, были проанализированы образцы почвы для выявления возбудителя почвообитающих, Spongospora subterranea. Spongospora был выбран как это важным картофеля возбудителя в качестве возбудителя порошистой8. В последние десятилетия наличие этого заболевания считается распространилась на многие регионы, где картофель выращивается9,10. Порошистой парши, благодаря присутствию прыщ как поражения клубней может привести к значительным качественным урожайности производителей картофеля. Кроме того S. subterranea может вектор картофеля Mop Топ вирус (PMTV), который может вызвать симптомы внутреннего поражения клубней (известный как spraing)11,12. Таким образом важно знать, если S. subterranea присутствует в областях до посадки6. Мы также продемонстрировать полезность настоящего протокола для обнаружения ризоктониоза Солани анастомоза Группа 3 (AG3) и PMTV. Хотя несколько групп анастомоза ризоктониоза Солани вызывают заболевания в картофель, AG3, возможно наиболее важным во всем мире13, вызывая стволовых язвы и войлочная, что приводит к потери товарного урожая до 30%14. PMTV вызывает некротические поражения внутри клубней, которые обычно называются spraing. Этот вирус недавно сообщалось в первый раз в нескольких государствах в Тихоокеанском северо-западе15,16,17и имеет большую озабоченность фермеры, в растущем регионе этот важный картофеля. Помимо определения эффективности портативный ПЦР для этих важных заболеваний, оптимального ДНК извлечения методологии и почвы размер выборки также были исследованы в этом исследовании.

Результаты показывают, что метод ПЦР портативный универсальный и применяется для обнаружения различных возбудителей. Метод на месте обнаружения, которую мы разработали может позволить прифронтовыми работников в сельском хозяйстве (например, производителей), чтобы сделать ранее решения, касающиеся управления болезни, такие как разнообразие выбора, или ротации и можно количественно завод патогена в образце во время проведения обследования на местах, до посадки, чтобы избежать потенциальных вспышек заболеваний.

Protocol

1. на месте молекулярной обнаружения патогенов, с помощью портативной системы PCR реального времени Примечание: Смотрите Рисунок 1. Магнитный шарик основе экстракции ДНКПримечание: Магнитный шарик на основе ДНК добыча комплект (например от Primerdesign) был использован в соответствии с инструкциями производителя. Все реагенты должны храниться при комнатной температуре (18-25 ° C). После того, как лиофилизированные протеиназы K (бутылка №1) приостанавливается (используя бутылка №1а), хранить при температуре от-20 ° C. Смешайте 20-50 мг образца грунта с 500 мкл пример решения Prep в микропробирок.Примечание: Отношение почвы: Prep решение имеет важное значение как смешивая их в другие соотношения может привести к сбою течению экспериментов (например, загрязнение, ингибиторы ПЦР). Размолоть почва в нижней части трубки, с помощью небольшой стерильные пестика до тех пор, пока решение Облачно. Дальнейшее приостановить частицы почвы в решении путем встряхивания Микропробирка и пусть она стоять, спокойно, чтобы позволить почвы, частицы оседают полностью (обычно от 5 до 10 минут). Перевести 200 мкл супернатант в свежий Микропробирка и 200 мкл буфера Lysis (бутылка № 2: решение Гуанидин гидрохлорид) и 20 мкл протеиназы K (бутылка № 1). Тщательно перемешать lysate, инвертирование трубки и инкубировать 15 мин при температуре окружающего воздуха.Примечание: Если lysate находится на крышке Микропробирка, коснитесь трубки или использовать центрифуги, если она доступна для удаления из крышки. Добавьте 500 мкл буфера/магнитный шарик смеси привязки (бутылка №3) лизированных образца. Смешайте хорошо закупорить вверх и вниз и инкубации при комнатной температуре за 5 минут от стойки магнитные трубки.Примечание: Убедитесь, что mix решение бисера перед использованием обеспечить бисер aliquoted равномерно от хранения бутылки. Место на стойку магнитные трубки микропробирка. Подождите на менее 2 мин или до тех пор, пока все бусины в Микропробирка придают магнитные боковой стенке. Затем снимите и Выбросьте все супернатанта, закупорить.Примечание: Не беспокоить намагниченные шарики во время удаления и аспирационных супернатант. ДНК, теперь был захвачен магнитной бусины. Удалите из стойки магнитные трубки микропробирка, 500 мкл мыть буфера-1 (бутылка № 4: перхлорат/этанола раствор натрия) и вновь приостановить бисер, неоднократные дозирование до тех пор, пока бисер равномерно рассредоточены. Выполните этот шаг стирки для удаления из образца протеина и соль. Пусть смесь сидеть за 30 s. Повторите шаг 1.1.6. Удалите из стойки магнитные трубки микропробирка, 500 мкл мыть буфера-2 (бутылка № 5: перхлорат/этанола раствор натрия) и вновь приостановить бисер, неоднократные дозирование до тех пор, пока бисер равномерно рассредоточены. Пусть смесь сидеть за 30 s. Повторите шаг 1.1.6. Удалите из стойки магнитные трубки микропробирка и затем добавить 500 мкл 80% этанола (бутылка No.6).Примечание: Этот шаг необходим для удаления остаточного солей из образца. Вновь приостановите бисер, неоднократные дозирование до тех пор, пока бисер равномерно рассредоточены. Пусть этот постоять 10 мин с случайного смешивания путем инверсии. Повторите шаг 1.1.6. Воздух сухой магнитный шарик Пелле за 10 мин при комнатной температуре с открытой крышкой микропробирок.Примечание: Бисер должен быть свободен от каких-либо видимых остаточных этанола, но не полностью высохли. Удалите из стойки магнитные трубки микропробирка, 50-200 мкл буфера (бутылка No.7) и вновь приостановить бисер, неоднократные дозирование до тех пор, пока бисер рассредоточены равномерно и дайте ему постоять 30 s.Примечание: В вышеуказанные шаги очищенная ДНК освобождается от магнитной бусины в Элюирующий буфер. Место на стойку магнитные трубки микропробирка. Подождите на менее 2 мин или до тех пор, пока все бусины в Микропробирка придают магнитные боковой стенке. Передача супернатанта, который теперь содержит очищенного ДНК/РНК до 0,5 мл микропробирок для использования в шагах вниз по течению. Портативный ПЦР в реальном времениПримечание: Портативный Термоциклер и комплект ПЦР анализа были использованы согласно инструкциям производителя (см. Таблицу материалов). Открыть и запустить программное обеспечение связанных Термоциклер, выберите тест обнаружения цели и ввода всю информацию о описание в поля ввода данных имя и детали, примечания, образцы и тесты .Примечание: Уэллс #1 и #2 определяются программного обеспечения для отрицательного контроля и позитивного управления, соответственно. Подготовьте ПЦР реактивы до использования. Передачи 500 мкл буфера ресуспендирования мастер смесь в трубку содержащих лиофилизированный мастер смесь и перемешать хорошо путем инверсии. Перевести весь главный микс в коричневый Микропробирка помечены грунты/зонд (Таблица 2). Крышка и поколебать Микропробирка смешивать. Тщательного смешивания требуется обеспечить, что все компоненты полностью вновь приостановлены. Пусть смесь сидеть в течение 5 минут перед использованием.Примечание: Храните смесь реакции при-20 ° C после использования. Подготовить отрицательный контроль путем перевода 10 мкл подготовленные реакции микс из предыдущего шага в 0.2 мл ПЦР-пробирку и затем добавить 10 мкл стерильной деионизированной воды, свободной от нуклеиназы. Подготовить положительный контроль путем перевода 10 мкл подготовленные реакции микс из шага 1.2.2 в 0.2 мл ПЦР-пробирку и затем добавить 10 мкл позитивного управления шаблона. Для каждого образца передача 10 мкл подготовленные реакции микс из предыдущего шага в 0.2 мл ПЦР-пробирку, а затем добавить 10 мкл образцов ДНК, приготовленный из шага 1.1.16. Загрузите скважин Термоциклер с содержимым от их соответствующих ПЦР трубы, как описано в шаге 2.1.1. После того, как вступил и подтвердил всю необходимую информацию выберите Начать работать и выберите диск USB или ethernet подключение инструмента.Примечание: Если выбран параметр диск USB, выполнения файл должен быть сохранен на диск для использования с Термоциклер (например, F:\genesig). Запуск начнется сразу же после того, как диск вставляется в Термоциклер. Анализ данных портативных ПЦР в реальном времени. После завершения запуска, откройте файл запуска (.usb) с диска USB с помощью программного обеспечения связанного Термоциклер или напрямую просматривать результаты выполнения в программном обеспечении, нажав результаты. Прежде чем анализировать результаты, сохраните заполненные бежать, чтобы избежать потери данных. На вкладке результаты , Просмотр состояния выполнения, категориям образцы.Примечание: Данные, которые могут быть получены в этой вкладке состояние результатов и скопируйте число обнаруженных в образце. Нажмите на вкладку сведения для просмотра амплификации кривых. Когда целевой объект успешно обнаружен, отображаются значения Cq (количественная оценка цикла) как целевых, так и внутреннего контроля.Примечание: Эти значения вычисляются в заключительном докладе и используются для определения ли образец является положительным для целевого объекта, и если есть проблемы с реакции или образцы ДНК. 2. другие протоколы Альтернативные методы экстракции ДНК на базе лаборатории CTAB-фенол хлороформ на основе методов Выполните CTAB-фенол хлороформ на основе методов, после Дойль метод18 и Dellaporta метод19 как описано выше. ДНК мини-подготовка методПримечание: Эдвардс метод20 была выполнена следующим образом. Добавьте 500 мг почвы, следуют пять 1,4 мм керамический бисер и 750 мкл буфера Эдвардс (200 мм трис, рН 8,0, 200 мм NaCl, 25 мм ЭДТА, 0,5% SDS) Микропробирка и смесь хорошо. Инкубируйте Микропробирка при 65 ° C за 5 мин. Однородный образца с шарик колотушки гомогенизатор для 60 s (или используя ступку и пестик). Центрифуга для образца в 14.000 x g за 5 мин. Передавать свежие Микропробирка 500 мкл супернатанта, затем смешать с 500 мкл охлажденные изопропанола. Смешайте инвертирование трубки 10 раз. Центрифуга для образца в 14.000 x g за 15 мин до гранулирование ДНК. Декант супернатант и пусть ДНК Пелле воздух сухой при комнатной температуре, пока остальные этанола испарится. Помойте лепешка ДНК с 750 мкл охлажденные 70% этанола. Воздух сухой гранул до повторного приостановления в 50-100 мкл буфера TE (10 мм трис-HCl, рН 8,0 и 1 мм ЭДТА). Другие альтернативные методы Выполните экстракции ДНК Silica база с помощью комплекта #1 (MP био быстро вращаться ДНК) и комплект #2 (комплект алкалический ДНК Zymo BIOMICS) в соответствии с инструкциями производителей. Обычных на базе лаборатории ПЦР в реальном времени.Примечание: Обычных Термоциклер был использован с mastermix зонд на основе ПЦР, различные грунтовки и зонды олигонуклеотида (Таблица 2). С помощью непрозрачных дном ПЦР трубы или ПЦР плита, готовить 20 мкл реакций для всех образцов ДНК для анализа, а также отрицательный контроль (свободной от нуклеиназы деионизированной воды) и положительный шаблон управления подготовлены собственными силами. Для каждого ПЦР трубки или хорошо, подготовить смесь включая 10 мкл mastermix, 7 мкл свободной от нуклеиназы деионизированной воды, 2 мкл 2 мкм грунты/зонда и 1 мкл образца ДНК (из шага 1.1.16, или 2.1) или шаблон элемента управления, на сэмпл. Закройте ПЦР трубы или пластины и начать реакции, выбрав соответствующую программу ПЦР. Анализ данных о обычных на базе лаборатории ПЦР в реальном времени Используйте связанные Термоциклер программное обеспечение для анализа результатов от обычных Термоциклер. Чтобы начать анализ данных, передачи выполнения файла с Термоциклер на диск USB, вставьте накопитель USB и выберите пункт Экспорт. Откройте из экспортированного файла данных (.pcrd) запуск Термоциклер связанного программного обеспечения. Выделите и образца, найдя соответствующий хорошо на инструменте. Амплификация кривых и стандартные кривые (если применимо) создаются автоматически. Если образец информации не введен, нажмите кнопку Плиты установки или аналогичные функции, чтобы начать ввод данных до анализа данных. Просмотр данных на вкладке количественной оценки; Это могут быть экспортированы для анализа данных с программным обеспечением третьих сторон, например, CSV, XML или HTML файл читателей. Получение данных Cq, основанные на определенных пороговых уровней и сравнить его с положительной и отрицательной контроля.Примечание: Если ДНК стандартов цели были использованы в assay, Сравните данные образца Cq, стандартов для определения светотеневой Cq

Representative Results

Сравнение методов извлечения ДНК Совместимость магнитные извлечения метода на основе бисера ДНК с ПЦР в реальном времени оценивалась путем обнаружения количества S. subterranea ДНК в образец почвы из полей, зараженных возбудителя. Как показано в дополнительном Рисунок 1, магнитный метод, основанный на шарик был по сравнению с другими методами, включая CTAB-фенол хлороформ на основе метода18, быстро ДНК мини-подготовка методы19,20и другие стандартные наборы для добычи на основе силики ДНК. Образцы ДНК, извлеченный с помощью шести различных методов были подвергнуты обычной на базе лаборатории ПЦР в реальном времени. Результаты предложил, что магнитный метод, основанный на шарик сопоставима с другими методами, хотя на основе силики комплект экстракции ДНК показали лучшую производительность среди методов мы тестировали. Все наборы содержат тиоцианат Гуанидиновые или Гуанидиновые гидрохлорид: оба являются мощными chaotropic агентов, которые денатурировать большинство клеточных белков, включая полиадениновый и DNases. Таким образом используя методы подходит для экстракции ДНК и РНК. Сравнение между портативный ПЦР в реальном времени и обычных на базе лаборатории ПЦР в реальном времени Для сравнения, чувствительность и специфичность портативный ПЦР для обычных на базе лаборатории ПЦР, абсолютное количественного определения возбудителя, выполненных ДНК, используя различные объемы ее ген S. subterranea , который был проведен вектор pGEM-T21 . Серия десятикратного разведений ее гена (106 до 10 копий0 ) были проанализированы с помощью набора грунты/зонд SsTQ22. Результаты показали, что портативный метод ПЦР обнаружены ДНК возбудителя целевой (~ 100 экземпляров), хотя чувствительность в 10 раз ниже, чем обычных метода, основанного на лабораторные PCR, который обнаружен по крайней мере 10 копий (рис. 2). Для дальнейшей проверки были протестированы искусственно зараженной почвы. S. subterranea sporosori были получены из порошистой корень галлы от корней картофеля. Почвы были infested с sporosori суспензий в конечной концентрации 105 sporosori/г сухого веса почвы. С помощью метода магнитной основе бисера, ДНК было извлечено от образцы зараженной почвы и десятикратного серийных разведений были готовы получить концентрации эквивалентна 105, 104, 103, 102, 101и 100 sporosori/г сухого веса почвы. Образцы ДНК были использованы для ПЦР, используя набор праймер/датчика SPO23. Результаты показали, что портативный метод PCR имеет сопоставимые аналитического потенциала для обычных лабораторного метода ПЦР, но, опять же, чувствительность был сокращен на фактор ~ 10 (рис. 3). Наконец мы протестировали образец почвы из поля, которое естественно загрязненных S. subterranea. Магнитный шарик основе экстракции ДНК была исполнена на различное количество почвы (10, 20, 50 и 100 мг почвы за 500 мкл извлечения буферного раствора). Результаты предложили оптимальный вес почвы в качестве исходного материала для экстракции ДНК 50-100 мг (рис. 4). Почвы суммы за пределами диапазона вызвало сбой вниз по течению шаги PCR. Этот эффект может быть потому, что когда избыточное количество почвы используются в качестве исходного материала, загрязнений (например, фенольные соединения) могут мешать ПЦР24. В случае снижения объемов почвы количество ДНК может быть ниже, чем предел обнаружения ПЦР (например, доходность всего разнообразны ДНК, извлеченные из почвы 10-20 мг). Чувствительность вполне сопоставима между портативный ПЦР и обычными методами ПЦР. Аналогичные результаты были получены в образцы ДНК различных извлечения методами (дополнительная цифра 2) Обнаружение других возбудителей на месте обнаружения системы, используя портативные ПЦР в реальном времени Мы протестировали портативный метод ПЦР для выявления других важных почвообитающих картофельных патогенов, р. Солани AG3 и PMTV. В этом исследовании мы провели ПЦР в реальном времени с помощью зонда набор25 грунты/RQP1 RsTq для р. Солани AG3 обнаружения с ДНК от чистой культуры. Мы также выполняются в реальном времени PCR праймер/зонда набор PMTV-D26 для обнаружения PMTV с РНК из образца симптоматическая клубней spraing было использовано. Как показано на рисунке 5, портативный метод ПЦР успешно обнаружен оба патогенов. Результаты были сопоставимы между портативным и обычных инструментов, о том, что метод ПЦР портативный универсальный и применимы для других случаев обнаружения возбудителя Если грунт последовательности, предназначен для ПЦР в реальном времени доступны. Рисунок 1. Процедура портативные системы реального времени ПЦР для выявления возбудителя на месте. Протокол состоит из шагов в следующем порядке: lysate подготовка краткого гомогенизации (A), добыча магнитный шарик на основе нуклеиновых кислот (B), портативный ПЦР в реальном времени (C), и анализа количественных данных, с помощью портативного компьютера (D). Обратите внимание, что все шаги можно выполнить на сайте. Рисунок 2 . Сравнение чувствительности между портативный ПЦР и обычных на базе лаборатории ПЦР. Количественное определение возбудителя ДНК была выполнена с использованием различных объемов ее геном S. subterranea (106 до 10 копий0 ) с SsTQ грунты/зонд. Линейной регрессии между журнала значения S. subterranea плазмида ДНК и взаимные журнала ов на обычных Термоциклер (A) и портативных Термоциклер (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 3 . Сравнение производительности и способности обнаружения искусственно зараженной почвы с S. subterranea. Почвы были искусственно зараженных (105 до 100 sporosori/г сухого веса почвы) с S. subterranea sporosori суспензий. С помощью метода магнитной основе бисера, ДНК было извлечено из зараженной почвы образцов. PCR были проведены с использованием образцов почвы с набором праймер/датчика SPO. Линейной регрессии между журнала значение начального количества в sporosori на грамм почвы и взаимные журнала значение Cq на обычных Термоциклер (A) и портативных Термоциклер (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 4 . Сравнение начиная количество образцов почвы для экстракции ДНК. Магнитный метод, основанный на шарик был использован для экстракции ДНК от 10, 20, 50 и 100 мг образцов почвы. Реальном масштабе времени PCR были проведены с использованием портативных Термоциклер. Стандартные кривые представляют отношения между сумму всего ДНК, извлеченные из проб почвы (ось x) и ПЦР продукта (ось y) усиливается наборе праймер/зонд Sss. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 5 . Обнаружение других картофельных патогенов, R. Солани и PMTV. Реальном масштабе времени PCR были проведены с использованием портативных Термоциклер и обычных Термоциклер. R. Солани AG3 был обнаружен в целом ДНК, извлеченные из чистой культуры с помощью RsTq грунты и RQP1 зонд, которые (A) PMTV был обнаружен в целом РНК, извлеченные из образца PMTV-инфицированных клубней с помощью набора праймер/зонд PMTV-D (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Рисунок 6 . Диагностики трубопроводов для фитопатогенов. Блок-схема показывает общий рабочий процесс для фитопатогенной диагностики. Обратите внимание, что традиционные шаг, например, визуальная идентификация, может быть опущен, если используется на месте молекулярной обнаружения, которая делает весь процесс диагностики, простой и быстрый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. Портативный ПЦР в реальном времени ПЦР в реальном времени ЛАМПА ELISA Боковой поток Стоимость за целевой реакции $0.60-$8,47 0,60 $ $0,75 0,60 $ $4.74 Чувствительность 100 копий 10 копий 10 копий 1-10 sporosori331-10 нг/мл (белка)33 1-10 sporosori345 x 105кое/мл35 Счет времени 90 минут 80-240 минут 50-90 минут32 3-24 часа 10-15 минут Требуется подготовка ●Nucleic кислоты добыча● Дизайн праймера ●Nucleic кислоты добыча● Праймер/зонд дизайн ● Nucelic кислоты добыча● Дизайн праймера ● Экстракция белка● Антитела Н/Д Другие материалы, необходимые ● Портативный Термоциклер ● Обычных Термоциклер ● колориметрического пятно● Инкубатор ● Плиты читатель● Моечное оборудование Н/Д Таблица 1. Сравнительная таблица обнаружения молекулярных и серологических методов для фитопатогенов Грунтовка Последовательность (5 ‘-3 ‘) B целевой SsTQ-F13 CCGGCAGACCCAAAACC ITS1-ITS2 в S. subterranea SsTQ-R13 CGGGCGTCACCCTTCA ITS1-ITS2 в S. subterranea SsTQ-P13 [FAM] CAGACAATCGCACCCAGGTTCTCATG [ТАМ] ITS1-ITS2 в S. subterranea Genesig S.subterranea грунт/зонд Н/Д Актина в S. subterranea SPO1014 GGTCGGTCCATGGCTTGA ЕЕ в S. subterranea SPO1114 GGCACGCCAATGGTTAGAGA ЕЕ в S. subterranea SPOPRO114 [FAM] CCGGTGCGCGTCTCTGGCTT [ТАМ] ЕЕ в S. subterranea RsTqF119 AAGAGTTTGGTTGTAGCTGGTCTATTT ITS1-ITS2 в р. Солани RsTqR119 AATTCCCCAACTGTCTCACAAGTT ITS1-ITS2 в р. Солани RQP119 [FAM] TTTAGGCATGTGCACACCTCCCTCTTTC [ТАМ] ITS1-ITS2 в р. Солани Genesig PMTV праймер/зонд Н/Д CP-RT в PMTV PMTV-D-F20 AGAATTGRCATCGAAACAGCA CP на PMTV PMTV-D-R20 GTCGCGCTCCAATTTCGTT CP на PMTV PMTV-D-P20 [FAM] CCACAAACAGACAGGTATGGTCCGGAA [ТАМ] CP на PMTV Праймеры oligo ДНК были изменены с FAM (6-Карбоксифлуоресцеина) или TAM (5-carboxytetramethylrhodamine) b ЕЕ: Внутренней трансляции распорки, CP: Пальто белка; CP-RT: Пальто белка readthrough Таблица 2. Грунты, используемые в данном исследовании Дополнительная цифра 1. Сравнение методов извлечения ДНК для обнаружения возбудителя порошистой. Шесть различных методов экстракции ДНК (A-F) были сопоставлены для выявления порошистой патогена, S. subterranea в пробах почвы. (B, D, F). ДНК было извлечено с помощью комплекта на основе силики #1 (см. таблицу материалов для всех имен, комплект), на основе силики комплект #2 и магнитного комплект на основе бисера, митрополитом. ПЦР была выполнена с использованием обычных Термоциклер ПЦР на базе лаборатории. Стандартные кривые представляют отношения между суммой всего ДНК, извлеченные из проб почвы и количество продукта PCR, усиливается наборе грунты/зонд SsTQ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель. Дополнительная цифра 2. Сравнение предел обнаружения между портативный ПЦР и обычных на базе лаборатории ПЦР. Всего ДНК был изолирован от пробы почвы с помощью трех методов извлечения различных: (метод, Дойл B), (C, D) на основе силики комплект #2 и (E, F) Магнитный комплект на базе шарик. Набор диаграмм показано на левой стороне являются данных с использованием портативных Термоциклер с набором грунты/зонд Sss, в то время как графики на право представлять данные, полученные с использованием обычных на базе лаборатории Термоциклер с SsTQ грунты/зонд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот показатель.

Discussion

Как показано в таблице 1, последние технологические достижения в молекулярной идентификации возбудителей увеличили эффективность, точность и скорость диагностики, которые способствовали обнаружению предварительно симптоматической инфекции27. Относительно занятия диагноз лампа бокового потока используются и методы часто потому, что они являются портативными и предоставлять немедленные результаты по более низкой цене. Однако в случае серологических методов, поставляемому обнаружения может быть трудно достичь. Это иногда вызывает я мимо микробов как общей почвы жителей. Например может существовать перекрестная реактивность между серологических тестов фитофторозом spp. и Pythium spp. в случае картофеля патогенов28, указывая, что иногда трудности выявления целевых завод патогенов.

В настоящем исследовании мы разработали оптимизированный протокол для занятия молекулярной обнаружения почвообитающих картофельных патогенов, используя портативные системы PCR реального времени, сравнивая его возможности с этим обычных лаборатории-системы на основе реального времени PCR. Мы обнаружили, что на месте метод специально обнаруживает картофельных патогенов в образце почвы, хотя чувствительность ~ 10 раз меньше, чем эквивалентный лабораторного анализа. Также стоит учесть, что в этом случае лабораторных и полевых испытаний не использовать биологически соответствующей выборки. Большие выборки необходимы для использования в регулярно скрининг поля почвы как описано29,30, где обрабатываются размеры образца от 250 г до 1 кг, хотя эти методы требуют квалифицированных операторов и сложные Оборудование для извлечения ДНК. Как правило крупномасштабные почвы, извлечь ДНК берется из одного совокупных почвы образца представителя многочисленных проб свыше 1 до 4 га6,29,30. Однако протокол, разработанный здесь быстрый, легкий в использовании для пользователей без предварительного опыта в молекулярной диагностики и могут использоваться за пределами лаборатории. Как метод является быстрым и относительно дешевым по сравнению с добычи крупномасштабные почвы, он может использоваться для многих небольших образцов, взятых из аналогичной области выборки для крупномасштабных статистических выборок. Это может преодолеть некоторые из недостатков небольшой размер выборки и определить дополнительную информацию о пространственном распределении возбудителя в поле. Кроме того, мобильность и скорость метода означает, что он может также использоваться в демонстрационных мероприятий для производителей для образовательных и целей участия.

Еще одним фактором является, что многие в реальном времени анализы ПЦР уже были опубликованы для широкого круга растения патогенов5. Эта система может сделать использовать этих существующих анализов, без необходимости для разработки новых лампа Праймеры для включения в полевых испытаний. Частые критика лампа анализов является, что они могут быть трудно разработать31. Портативный PCR, таким образом, позволяет сравнительно легко реализовать широкий спектр легко доступны возбудителя тесты для тестирования на месте.

Традиционные методы могут быть часто дорогостоящих, кропотливая, неточными и длительным. Простота метода на месте, которое мы разработали позволяет производителей и работников промышленности для выполнения обнаружения возбудителя самостоятельно и возможно генерировать результат гораздо быстрее, чем отправлять диагностические лаборатории, которые могут быть на некотором расстоянии. Оперативность и чувствительность портативный метода ПЦР может помочь фермерам избежать потенциальных вторичных инфекций, которые могут еще больше увеличить патогена населения и непреднамеренное распространение (через оборудование или людей). В заключение на месте метод, разработанный в настоящем исследовании позволяет точную и относительно чувствительных обнаружение важных почву патогенов в поле. Мы надеемся, что на месте метод, разработанный в этом исследовании будет способствовать в текущей диагностики трубопроводов (рис. 6), не только предоставляя быстрые и точные ответы на эпидемиологических вопросы о болезни растений в поле, но и предоставляя возросшее понимание биологии и эпидемиологии патогенов растений.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарны д-р Нил C. Gudmestad в университете штата Северная Дакота для предоставления S. subterranea плазмиды, доктор Hanu Паппу в Вашингтон государственного университета (Вашингтон) для предоставления PMTV РНК и д-р Дебра Инглис в Вашингтон для предоставления R. Солани AG3. Отдельное спасибо доктор Джереми Jewell в Вашингтон для представления замечаний по рукописи и WSU CAHNRS коммуникаций для видео. Это исследование было поддержано консорциум исследований картофеля Северо-Запада и Вашингтон государственного департамента сельского хозяйства – специальность культур блок Грант программы (Грант нет. K1764). PPNS № 0741, Департамент фитопатологии, колледж сельского хозяйства, наук людских и природных ресурсов, сельскохозяйственной научно-исследовательский центр, Люк проекта № WNP00833, Университет штата Вашингтон, Pullman, Вашингтон, США.

Materials

White shell PCR plate Bio-Rad HSP9601
CFX Manager Bio-Rad 1845000
SsoAdvanced Universal Probes Supermix  Bio-Rad 1725280
CFX96 Touch qPCR instrument Bio-Rad  1855195
Ethylalcohol, pure 200 proof Decon Laboratories 04-355-222
Masterclear cap strips & real‑time PCR tube strips Eppendorf 9510222109
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) Fisher BioReagents BP118-500
Phenol, Saturated  Fisher BioReagents BP1750I-400
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) Fisher BioReagents BP152-5
q16 real-time PCR machine genesig MBS486001
Ultrapure Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Invitrogen 15525-017
2-Propanol (Isopropanol) JT Baker 67-63-0
Chloroform JT Baker 9180-03
Hydrochloric Acid, 36.5-38.0% (HCl) JT Baker 9535-03
iso-Amyl Alcohol JT Baker 9038-01
FastDNA Spin kit  MP Biomedicals 6560-200 Silica-based DNA extraction kit #1
Luna Universal One-Step RT-qPCR Kit New England Biolabs E3005S
0.1ml Low Profile Individual PCR Tubes Phenix Research MPC-100LP
Easy DNA/RNA Extraction Kit  Primerdesign genesigEASY-EK
genesig Easy 1.5 mL tubes Primerdesign genesigEASY-1.5
Magnetic tube rack Primerdesign genesigEASY-MR
Spongospora subterranea f. sp. subterranea genesig Easy Kit Primerdesign Path-S.subterranea-EASY
Hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) Sigma-Aldrich H6269-100G
Pellet pestles Thermo Fisher Scientific 12-141-364
Sodium chloride (NaCl) Thermo Fisher Scientific 7647-14-5
DNA Miniprep kit  ZymoBIOMICS D4300 Silica-based DNA extraction kit #2
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Malcolm, G. M., Kuldau, G. A., Gugino, B. K., Jiménez-Gasco, M. d. e. l. M. Hidden Host Plant Associations of Soil-borne Fungal Pathogens: An Ecological Perspective. Phytopathology. 103 (6), 538-544 (2013).
  2. Posthuma-Trumpie, G. A., Korf, J., van Amerongen, A. Lateral flow (immuno)assay: its strengths, weaknesses, opportunities and threats. A literature survey. Anal Bioanal Chem. 393 (2), 569-582 (2009).
  3. Hill, J., et al. Loop-Mediated Isothermal Amplification Assay for Rapid Detection of Common Strains of Escherichia coli. J Clin Microbiol. 46 (8), 2800-2804 (2008).
  4. Mumford, R. A., Walsh, K., Barker, I., Boonham, N. Detection of Potato mop top virus and Tobacco rattle virus Using a Multiplex Real-Time Fluorescent Reverse-Transcription Polymerase Chain Reaction Assay. Phytopathology. 90 (5), 448-453 (2000).
  5. Schena, L., Nigro, F., Ippolito, A., Gallitelli, D. Real-time quantitative PCR: a new technology to detect and study phytopathogenic and antagonistic fungi. European Journal of Plant Pathology. 110 (9), 893-908 (2004).
  6. Brierley, J. L., Stewart, J. A., Lees, A. K. Quantifying potato pathogen DNA in soil. Applied Soil Ecology. 41 (2), 234-238 (2009).
  7. Tomlinson, J. A., Boonham, N., Hughes, K. J. D., Griffin, R. L., Barker, I. On-Site DNA Extraction and Real-Time PCR for Detection of Phytophthora ramorum in the Field. Appl Environ Microbiol. 71 (11), 6702-6710 (2005).
  8. Harrison, J. G., Searle, R. J., Williams, N. A. Powdery scab disease of potato – a review. Plant Pathology. 46 (1), 1-25 (1997).
  9. Johnson, D. A., Miliczky, E. R. Distribution and development of black dot, Verticillium wilt, and powdery scab on Russet Burbank potatoes in Washington State. Plant Disease. 77 (1), 74-79 (1993).
  10. Merz, U. Powdery Scab of Potato-Occurrence, Life Cycle and Epidemiology. Am J Pot Res. 85 (4), 241 (2008).
  11. Jones, R. a. C., Harrison, B. D. The behaviour of potato mop-top virus in soil, and evidence for its transmission by Spongospora subterranea (Wallr). Lagerh. Annals of Applied Biology. 63 (1), 1-17 (1969).
  12. Carnegie, S. F., Davey, T., Saddler, G. S. Effect of temperature on the transmission of Potato mop-top virus from seed tuber and by its vector, Spongospora subterranea. Plant Pathology. 59 (1), 22-30 (2010).
  13. Woodhall, J. W., Adams, I. P., Peters, J. C., Harper, G., Boonham, N. A new quantitative real-time PCR assay for Rhizoctonia solani AG3-PT and the detection of AGs of Rhizoctonia solani associated with potato in soil and tuber samples in Great Britain. Eur J Plant Pathol. 136 (2), 273-280 (2013).
  14. Banville, G. J. Yield losses and damage to potato plants caused by Rhizoctonia solani Kuhn. American Potato Journal. 66 (12), 821-834 (1989).
  15. Crosslin, J. M. First Report of Potato mop-top virus on Potatoes in Washington State. Plant Disease. 95 (11), 1483-1483 (2011).
  16. Whitworth, J. L., Crosslin, J. M. Detection of Potato mop top virus (Furovirus) on potato in southeast Idaho. Plant Disease. 97 (1), 149-149 (2012).
  17. Kaur, N., Cating, R. A., Dung, J. K. S., Frost, K. E., Robinson, B. A., Hamm, P. B. First Report of Potato mop-top virus Infecting Potato in Oregon. Plant Disease. 100 (11), 2337 (2016).
  18. Doyle, J. J. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. 12, 13-15 (1990).
  19. Dellaporta, S. L., Wood, J., Hicks, J. B. A plant DNA minipreparation: Version II. Plant Mol Biol Rep. 1 (4), 19-21 (1983).
  20. Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis. Nucleic Acids Research. 19 (6), 1349 (1991).
  21. Bittara, F. G., Secor, G. A., Gudmestad, N. C. Chloropicrin Soil Fumigation Reduces Spongospora subterranea Soil Inoculum Levels but Does Not Control Powdery Scab Disease on Roots and Tubers of Potato. Am J Potato Res. 94 (2), 129-147 (2017).
  22. van de Graaf, P., Lees, A. K., Cullen, D. W., Duncan, J. M. Detection and Quantification of Spongospora subterranea in Soil, Water and Plant Tissue Samples Using Real-Time PCR. European Journal of Plant Pathology. 109 (6), 589-597 (2003).
  23. Maldonado, H., Falloon, R. E., Butler, R. C., Conner, A. J. Spongospora subterranea root infection assessed in two potato cultivars differing in susceptibility to tuber powdery scab. Plant Pathology. 62 (5), 1089-1096 (2013).
  24. Braid, M. D., Daniels, L. M., Kitts, C. L. Removal of PCR inhibitors from soil DNA by chemical flocculation. Journal of Microbiological Methods. 52 (3), 389-393 (2003).
  25. Lees, A. K., Cullen, D. W., Sullivan, L., Nicolson, M. J. Development of conventional and quantitative real-time PCR assays for the detection and identification of Rhizoctonia solani AG-3 in potato and soil. Plant Pathology. 51 (3), 293-302 (2002).
  26. Davey, T., Carnegie, S. F., Saddler, G. S., Mitchell, W. J. The importance of the infected seed tuber and soil inoculum in transmitting Potato mop-top virus to potato plants. Plant Pathol. 63 (1), 88-97 (2014).
  27. Boonham, N., et al. Methods in virus diagnostics: From ELISA to next generation sequencing. Virus Research. 186, 20-31 (2014).
  28. Mohan, S. B. Cross-reactivity of antiserum raised against Phytophthora fragariae with other Phytophthora species and its evaluation as a genus-detecting antiserum. Plant Pathology. 38 (3), 352-363 (1989).
  29. Ophel-Keller, K., McKay, A., Hartley, D., Curran Herdina, J. Development of a routine DNA-based testing service for soil-borne diseases in Australia. Austral Plant Pathol. 37 (3), 243-253 (2008).
  30. Woodhall, J. W., et al. A new large-scale soil DNA extraction procedure and real-time PCR assay for the detection of Sclerotium cepivorum in soil. Eur J Plant Pathol. 134 (3), 467-473 (2012).
  31. Miles, T. D., Martin, F. N., Coffey, M. D. Development of Rapid Isothermal Amplification Assays for Detection of Phytophthora spp in Plant Tissue. Phytopathology. 105 (2), 265-278 (2014).
  32. Notomi, T., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28 (12), e63-e63 (2000).
  33. Narayanasamy, P. . Microbial Plant Pathogens: Detection and Management in Seeds and Propagules. , (2016).
  34. Braun-Kiewnick, A., Altenbach, D., Oberhänsli, T., Bitterlin, W., Duffy, B. A rapid lateral-flow immunoassay for phytosanitary detection of Erwinia amylovora and on-site fire blight diagnosis. Journal of Microbiological Methods. 87 (1), 1-9 (2011).

Tags

On-site DetectionSoil-borne PhytopathogensPortable Real-time PCRMagnetic Bead-based DNA ExtractionPotato PathogensSpongospora SubterraneaField DiagnosisPlant Pathogen Detection

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
DeShields, J. B., Bomberger, R. A., Woodhall, J. W., Wheeler, D. L., Moroz, N., Johnson, D. A., Tanaka, K. On-Site Molecular Detection of Soil-Borne Phytopathogens Using a Portable Real-Time PCR System. J. Vis. Exp. (132), e56891, doi:10.3791/56891 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image