简化的3D 小脑鉴别协议, 可选2D 修改

1. 准备工作 注意: 对于所有步骤, 请参阅特定物料的材料表。 为 hPSC 文化准备500毫升定义的 hPSC 培养基注: 步骤 2.1-2.6 使用介质。 在4° c 夜间解冻 hPSC 培养基补充剂 (o/n)。从中瓶中取出12.5 毫升的 hPSC 基培养基, 然后加入10毫升的补充剂和2.5 毫升 (使 100 U/升) 青霉素/链霉素 (笔/链球菌) 的瓶子。 贮存于4° c, 2 周内使用。注: hPSC 培养基可通过添加10µM 岩石抑制剂 (RI) 和10% 亚砜来冻结细胞。 准备 1 L 神经维持培养基 (NMM) 进行分化培养注: 步骤 3.1-4.4 使用介质。 混合谷氨酰胺强化 DMEM/F12 和神经碱性培养基 (1:1 比) 在一个1升瓶, 然后补充 (1x) N2 补充剂, (1x) B27 补充, 5 µg/毫升胰岛素, 1.5 毫米 l-谷氨酰胺, 100 µM 非必需氨基酸 (NEAA), 100 U/l 笔/链球菌, 10 µMβ-基 4° c 贮存介质, 3 周内使用。注: 在将补充剂添加到混合基介质之前, 请删除适当的音量以根据库存浓度调整所需的添加元件体积。 为传代 hPSCs 准备500毫升0.5 毫米 EDTA 工作溶液注: 步骤2.4 和2.5 使用介质。 在流罩下, 将49毫升磷酸缓冲盐水 (pbs) 从500毫升无菌 pbs 瓶转移到50毫升管。在50毫升管中加入0.5 毫升的 0.5M EDTA 和0.9 克氯化钠。轻轻地混合溶解。 过滤消毒解决方案使用0.22 µm 过滤器和转移到500毫升消毒 PBS 瓶。室温贮存 (RT)。 为 hPSC 文化准备 hPSC 文化板块注: 使用板的步骤 2.1-2.6。 制作 50x hPSC-适当的贴附涂层 (评定总署) 的工作解决方案: 解冻4° c 的评定总署的一瓶。稀释评定总署在1:1 的比例与 DMEM/F12 和转移为400µL 等分成1.5 毫升管。存储50x 工作解决方案评定总署在-80 ° c。注: (重要) 评定总署在 RT 中快速固化, 因此所有组件 (DMEM、管、等) 都必须在冰上 (或在4° c) 上保存。 50x 工作溶液的解冻管在4° c, 然后在冷 DMEM/F12 中稀释50x。添加750µL/井稀释评定总署为6WP。孵育板至少1小时在37° c。注: 在4° c 下, 在 1 h 潜伏期后将钢板包裹起来, 可将该板材储存1周。预热盘至37° c 前使用。 为鉴别培养制备抗粘连 (AA) 板注: 使用板的步骤 3.1-4.1。 用95% 乙醇生产5毫克/毫升聚 (2-羟乙基甲基丙烯酸酯) 溶液。在37° c 时摇动 o/n 直到得到清晰的解。存储在 RT。注: 通过0.22 µm 过滤器过滤可去除溶。 在培养基中加入多聚, 使其覆盖每一个井的底部。在37° c 下孵育2天, 并检查板材以确保液面/均匀涂层的完全蒸发。AA 板可以包装和存储在 RT。 制备聚 l-鸟氨酸/层粘连蛋白 (巴解组织/林) 板的分化培养注: 使用板的步骤 4.2-4.4。 用20µg/毫升巴解组织溶解在无菌 PBS 中, 涂上井的表面积。在37° c 下孵育板 o/n。吸气, 用 PBS 冲洗3次。注: (可选) 带巴解组织的孵育板可包装并贮存在4° c, 直至需要。 用10µg/毫升的林在无菌 PBS 中溶解, 在巴解组织涂层的水井表面涂敷。孵育至少2小时在37° c 或 o/n 在4° c。用 PBS 将林和洗井 2-3x, 然后立即添加适当的培养基和/或细胞。注: (可选) 去除的 LAM 溶液可贮存在4° c, 再使用2倍。(重要)不允许涂覆的表面晾干;为了防止这种情况立即添加 PBS 或适当的媒体。   2. 议定书 1: 无馈线 hPSC 文化 注: 干细胞是从非商业组织 (行 H01, 请参阅材料表) 获得的。三 hiPSC 控制线 (hvs51, 60, 和 88) 是由三健康的人患者 (成纤维细胞从匿名, 非可识别的捐赠者获得, 因此免于 IRB 批准) 产生的成纤维细胞,10, 17。 保持 hPSCs 的无饲养文化 在解冻和电镀 hPSCs 到评定总署的 hPSC 介质板 (见步骤 2.2), 维护 hPSCs 在37° c 与 5% CO2。刷新 hPSC 介质 (参见步骤 2.3), 除解冻或传代后的次日, 并检查显微镜下的细胞 (目标: 2.5x/0.06, 5 x/0.12 Ph0, 10 x/0.25 Ph1) 观察生长速率并识别分化的潜在区域 (图3, 左上面板显示差异的示例)。 通过 hPSCs 每3-4 天, 或当文化达到 > 80% 汇合。如果少于5% 的细胞表现出分化, 使用正常的 hPSC 传代方法 (见步骤 2.4), 否则使用温和的方法 (见步骤 2.5)。当不再需要的文化, hPSCs 可能会冻结长期存储 (见步骤 2.6)。 hPSC 介质中的解冻 hPSCs 将所需的 hPSC 介质的体积转化为解冻过程的无菌管 (9 毫升/低温管) 和准备好的评定总署接收解冻的细胞。补充在两个管中的培养基与10µM RI。 从2存储中检索 cryotube, 并将其直接放入水浴 (37 ° c) 中。当仅一个小冰晶遗骸的, 从水浴去除并且转移低温管子的内容到管子为解冻过程 (总容量10毫升)。离心管在 290 x g 为5分钟在 RT。 使用血清学吸管从评定总署的油井中移除评定总署的溶液 (见步骤 1.4), 目的是接收细胞, 并添加 hPSC 培养基与10µM RI。注意: (重要) 不要用吸针吸入评定总署的解决方案, 也可以将管线固化并堵塞到真空泵。 用10µM RI 将 hPSC 培养基中的上清液和重细胞去除。将单元格分布到目标板, 比例为1低温管/井6WP。孵育在37° c 与 5% CO2, 并且不刷新媒介为1天。注意: 在 5% O2处启动单元格可能会增加细胞存活率。 刷新 hPSC 介质 在 RT 或水浴中, 在无菌管中加热必要的 hPSC 培养基体积;建议2毫升/井6WP。注: (可选): 通过添加额外的 hPSC 培养基, hPSCs 可以保持额外的一天没有刷新;但是, 不要让这一周超过一次。 从含有 hPSCs 的水井中吸取培养基, 添加新鲜的 hPSC 培养基。 培养 hPSCs 在一个孵化器在37° c 和 5% CO2。 hPSC 介质中的通道 hPSCs 将所需的 hPSC 介质的体积转移到无菌管, 用于传代过程, 并用于制备评定总署的板材以接收传代细胞。以10µM RI 为目的板补充培养基。在 RT 或水浴中加热介质管。注: 如果使用比材料表中列出的替代涂层材料, 则准备和处理将有所不同。 使用血清学吸管从评定总署的油井中移除评定总署的溶液 (见步骤 1.4), 目的是接收细胞, 并添加 hPSC 培养基与10µM RI。注意: (重要) 不要用吸针吸入评定总署的溶液, 因为它可能会凝固并堵塞真空泵的管线。 从井中抽出 hPSCs 传代, 用0.5 毫米 edta 冲洗两次细胞, 再加入0.5 毫米 edta, 在37° c 孵育2-5 分钟。注: 1 毫升/井6WP 是一个足够的体积 EDTA 的洗涤和孵化。 检查显微镜下的水井 (目标: 2.5x/0.06, 5 x/0.12 Ph0, 10 x/0.25 Ph1)。如果细胞开始分离, 用 hPSC 培养基吸出 EDTA 溶液并释放细胞。注: (重要) 注意不要在吸 EDTA 时移除整个 hPSC 菌落 (不要等到整个菌落分离)。不要冲洗细胞超过5次, 因为这可能伤害 hPSCs 和影响多。此外, 不要让细胞站在 hPSC 介质与 RI 前冲洗细胞从水井, 因为他们可能会重新坚持板。 根据经验确定 (通常与汇合, 殖民地大小和增长率), 转移 hPSCs 到目标板块的井用分裂比率 1:4-1:16 (即, 1 井从原始的板材到4井目标板)。孵育在37° c 与 5% CO2, 并且不刷新媒介为1天。注: 分裂率高达 1:16-1:20 是可能的, 以防止拥挤和改善外观的殖民地。 用温和法 (g-法) hPSCs 通道 将所需的 hPSC 介质的体积转移到无菌管, 用于传代过程, 并用于制备评定总署的板材以接收传代细胞。以10µM RI 为目的板补充培养基。热媒管在 RT, 或在水浴在37° c。 使用血清学吸管从评定总署的油井中移除评定总署的溶液 (见步骤 1.4), 用于接收细胞, 并添加 hPSC 培养基与10µM RI。注: (重要) 不要用吸针吸入评定总署, 也可以将管线固化并堵塞到真空泵。 从 hPSCs 的井中抽出培养基传代, 用0.5 毫米 EDTA 冲洗两次细胞。在第二次洗涤, 等待三十年代之前, 吸 EDTA, 然后添加1毫升 PBS 和孵化4-9 分钟在37° c。等待时, 用4毫升 PBS 制备无菌管。注: 1 毫升/井6WP 是足够的 EDTA 的洗涤量。 检查显微镜下的水井 (目标: 2.5x/0.06, 5 x/0.12 Ph0, 10 x/0.25 Ph1)。如果细胞开始分离, 小心地敲击盘子的两侧来帮助自由的殖民地。当 > 50% 的殖民地是自由漂浮, 使用5毫升血清吸管转移到1毫升 pbs 的菌落到含有4毫升 pbs 的管 (不研制)。注意: (重要) 因为目的是清理 hPSC 的区域性, 请检查以确定区分的单元格是否仍然附着在板上。此外, 这是没有必要通过所有的殖民地在一个良好的使用这个过程, 所以仍然依附的殖民地可能会留下。 在 RT 中等待5-10 分钟, 使细胞在试管中沉淀 (不要离心)。从试管中抽吸 PBS, 注意不要移除已沉淀的 hPSCs。仔细重 hPSC 培养基中的细胞 (不研制), 并将细胞转移到目标板上, 使用分裂率为 1:4-1:16。孵育在37° c 与 5% CO2, 并且不刷新媒介为1天。 冻结 hPSCs 根据合流, 使用1井的 hPSCs, 在2-3 天 (最大) 的文化, 以填补1-2 冷冻保存瓶储存在 LN 在2。 在传代 (步骤 2.5) 的末端, 使用500µL 或1毫升的 hPSC 培养基将细胞从1井的6WP 到1或2冷冻小瓶, 分别 (500 µL/瓶)。每管, 添加500µL 2x 冷冻培养基含有 hPSC 培养基, 20 µM RI, 20% 亚砜。注: (可选) 细胞可直接在1毫升/瓶的1x 冷冻介质中传输。 将低温管置于低温容器中 (含异丙醇) 预冷却至4° c, 并立即贮存在-80 ° c。 第二天, 将低温管传输至 LN2罐中进行长期贮存。 3. 议定书 2: 3D “化” 的区别 hPSCs 传代的改性 G 化方法的建立 将所需的 NMM 量转移到无菌管的目标井数。补充 4 ng/毫升 FGF2 和10µM RI。在 RT 处加热介质管, 或在37° c 的水浴中预热。注: 根据起始井的汇合, hPSCs 集中在分配到目的板材在2:1 或3:1 比率 (即, 2 口井从原始的板材到1井目标板材), 以末端容量2.5 毫升/井6WP。 将含有 hPSCs 的井中的培养基抽吸, 用0.5 毫米 EDTA 清洗两次细胞。在第二次洗涤, 等待三十年代之前, 吸 EDTA, 然后添加1毫升 PBS 和孵化4-9 分钟在37° c。等待时, 用4毫升 PBS 制备无菌管。注: 1 毫升/井6WP 是足够的 EDTA 的洗涤量。(重要)最好使用在最后一段时间内不超过3天的 hPSCs, 在解冻后至少1-2 通道。 检查显微镜下的水井 (目标: 2.5x/0.06, 5 x/0.12 Ph0, 10 x/0.25 Ph1)。如果细胞开始分离, 通过轻轻敲击板的两侧释放细胞。将细胞转移到含有5毫升吸管的4毫升 PBS 的试管中。注意: (重要) 光冲洗和研磨被允许分解菌落和收集松散的细胞, 但忽略仍然附着在板上的细胞。 允许管在 RT 上坐10分钟, 用于重力分离。(可选) 如果需要, 可以将细胞轻轻地离心 (不大于 200 x g, 在 RT, 5 分钟)。 从试管中吸取 PBS, 注意不要移除固定的 hPSCs, 重 NMM 的细胞, 用 4 ng/毫升 FGF2 和10µM RI, 然后以2:1 或3:1 的比例分布到 AA 涂层板上。孵育在37° c 与 5% CO2, 并且不刷新媒介为3天, 除非需要 (参见步骤 3.2.1)。注: (可选) 为了方便转移细胞, 在分布前将培养基的一部分添加到目标板的井中, 并重在较小的体积内。此外, hPSCs 可能被染色和计数, 以确定确切的起始细胞密度。然而, 最终的体积在目标板块应该是2.5 毫升/井的6WP。 在37° c (5% CO2) 上保持自由浮动差异化培养 每天检查盘子中的颜色变化, 死细胞堆积, 结块, 并坚持到井底。 可选: 无论介质更改时间表如何, 刷新 (包括前3天不刷新) 介质 (如果已变成黄色), 并按照中的更改/刷新说明 (步骤 3.3)。如果大多数细胞出现死亡, 按照指示进行介质变化/刷新与重力分离 (步骤 3.4)。注意: 预期形成的 EBs 和成长为大细胞聚集物, 但细胞和细胞聚集可以聚集成大质量不是由于个人的生长/增殖。如果这被观察, 轻的研磨打破大量是允许的。如果细胞开始黏附在 AA 板表面, 剩余的漂浮的内容可能直接地转移到新的井或转移在过程中中度变化或刷新。不要试图转移附着在板上的细胞。 3天, 将培养基改成 NMM, 4 ng/毫升 FGF2。每隔一天刷新一次介质。 7天, 用1µM 维甲酸 (RA)、100 ng/毫升 FGF8B 和 4 ng/毫升 FGF2 将培养基改 NMM。每隔一天刷新一次介质。注意: (重要) RA 是光敏的。保护镭文化样品免受光照。 14天, 用 100 ng/毫升 FGF8B、100 ng/毫升 FGF4 和 20 ng/ml FGF2 将培养基改成 NMM。每隔一天刷新一次介质。 17天, 将培养基改成 NMM, 100 ng/毫升 FGF8B。每隔一天刷新一次介质。 在21天, 改变培养基到 NMM 与 100 ng/毫升脑源性神经营养因子 (BDNF) 和 10 ng/毫升胶质来源神经营养因子 (GDNF)。每隔一天刷新一次介质。 在28天, 改变培养基到 NMM 与 100 ng/毫升 BDNF 和 10 ng/毫升 GDNF, 3 ng/毫升, 100 ng/毫升神经营养因子 3 (NT3), 和25毫米氯化钾. 每隔一天刷新一次介质。 35天, 收集 3D organoids 进行分析。 更改/刷新3D 文化的差异媒体 将所需的 NMM 量与相应的组件进行传输 (请参阅步骤 3.2. 2-3. 2.7 的组件时间表) 到无菌管。温水浴在37° c。 把盘子轻轻摇动, 直到细胞沉淀到井底边缘。用血清吸管小心去除2毫升的旧培养基, 避免移除细胞, 然后加入2毫升的新鲜培养基。孵育在37° c 与 5% CO2。注: (重要) 最终音量应为2.5 毫升/6WP。如果蒸发发生, 不要去除2毫升的旧培养基, 因为这将进一步干燥细胞培养;相反, 添加额外的媒体。 利用重力分离改变/刷新微分介质 将所需的 NMM 量与适当的元件转移到无菌管。温水浴在37° c。 将井内的内容转移至无菌管, 并允许该管在 RT 处坐10分钟, 用于重力分离。 使用吸管去除管中的旧介质, 注意不要移除已沉淀的细胞, 在 NMM 中用适当的成分重, 然后分配给新的 AA 涂层井。孵育在37° c 与 5% CO2。注: (可选) 为了方便起见, 在分配前可以在目标井中添加一部分培养基, 将细胞悬浮在较低的体积内。最终体积应为2.5 毫升/6WP。 4. 议定书 3: 备选2D 差异文化 按照3节中的步骤启动和维护区域性, 以便在12天后使用3D 协议 按照步骤3.3 和3.4 执行步骤 3.1-3.2. 3 和更改/刷新介质。 切换到并保持为2D 单层培养 在13天的差异化, 按照指示的变化/刷新介质与重力分离 (步骤 3.4), 只分配细胞/骨料到巴解组织/LAM 涂层板 (见步骤 1.6) 的结束量2.5 毫升/井的6WP。注: 在初始电镀期间, 培养基可辅以10µM RI, 以帮助细胞的黏附和存活。(重要)最好是均匀地在井中传播细胞, 以避免低密度或拥挤的板块, 并通过 (见步骤 4.4) 必要的。必须根据细胞系的增殖率和产品的用途, 从经验上确定巴解组织/LAM 涂层板 (即、6WP、12WP、等) 的首选尺寸。指令将给6WP 的体积, 并可以转换为每加倍的井号 (即, 2 毫升/良好的 6WP, 1 毫升/良好的 12WP,等) 14天, 用 100 ng/毫升 FGF8B、100 ng/毫升 FGF4 和 20 ng/ml FGF2 将培养基改成 NMM。如步骤4.3 所述, 每隔一天刷新一次介质。 17天, 将培养基改成 NMM, 100 ng/毫升 FGF8B。如步骤4.3 所述, 每隔一天刷新一次介质。 在21天, 改变培养基到 NMM 与 100 ng/毫升 BDNF 和 10 ng/毫升 GDNF。如步骤4.3 所述, 每隔一天刷新一次介质。 在28天, 改变培养基到 NMM 与 100 ng/毫升 BDNF 和 10 ng/毫升 GDNF, 3 ng/毫升凹陷, 100 ng/毫升 NT3, 和25毫米氯化钾. 每隔一天刷新一次介质, 如步骤4.3 所述。 在35天, 收集用于分析的单元格, 或与扩展区域性的步骤4.2.5 保持相同的介质 (未测试潜在限制)。 更改/刷新2D 文化的差异媒体 将所需的 NMM 量与适当的组件进行传输 (请参阅步骤 4.2. 2-4. 2.5 的组件时间表) 到无菌管。温水浴在37° c。 从水井中吸取培养基, 然后加入2毫升新培养基。孵育在37° c 与 5% CO2。注: (可选) 端部容积可保持在2.5 毫升/6WP, 使用吸管去除2毫升的旧培养基和增加2毫升的新鲜培养基。在井中保留部分旧培养基, 防止细胞与空气接触, 可在改变步骤时减少对细胞的冲击。 通道2D 分化培养 将所需的 NMM 量与相应的组件 (参见步骤 4.2. 2-4. 2.5) 转到无菌管、传代过程, 以及分别准备用于接收传代细胞的巴解组织/LAM 涂层板。用10µM RI 补充目的板的培养基。在 RT 或在37° c 的水浴中加热介质管。为了节省组件, 可以单独使用 NMM 在传代过程中清洗细胞。注: (重要) 如果产品将用于钙显像实验中, 确保通过细胞在2-6 天前分化结束。 从水井中吸取传代。添加300µL/井的胰蛋白酶为基础的离解剂 (见材料表), 旋流板覆盖井, 然后立即删除离解剂。 允许板在 RT 上坐2分钟, 然后通过敲击板的两侧松开电池。添加600µL/良好定义的胰蛋白酶抑制剂 (dti) 和转移的细胞 dti 到一个无菌管与5毫升 NMM。 离心管在 290 x g 为15分钟, 在 RT. 吸气培养基, 再加5毫升 NMM 到试管。 离心管在 290 x g 为15分钟, 在 RT. 吸气培养基, 并在含有 RI 的适当培养基中重细胞。 根据初始汇流、扩散速率和原点与目标板的大小差异, 将巴解组织/LAM 板上的单元分布在 1:1-1:12 的分裂比例上, 并在37° c 与 5% CO2之间保持。