Dieses Protokoll soll die Oberflächentechnik der pankreatischen Inselchen mit ein Heparin-integriert StarPEG NanoCoatings über Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen N– Hydroxysuccinimide-Gruppen der NanoCoatings und Amin Gruppen der Insel Zellmembran.
Zelle Oberflächentechnik kann implantierte Zellen vor Gastgeber immun Angriffen schützen. Es kann auch Umformen, zelluläre Landschaft zur Verbesserung der Organfunktion und Überleben nach Transplantation. Dieses Protokoll zielt auf Oberflächentechnik der pankreatischen kleinen Inseln mit einer ultradünnen Heparin enthalten StarPEG (Hep-PEG) NanoCoatings. Um die Hep-PEG NanoCoatings für Bauchspeicheldrüsenkrebs Inselchen Oberflächentechnik zu generieren, Heparin Succinimidyl Succinat (Heparin-NHS) wurde erstmals synthetisiert durch Änderung seiner carboxylat-Gruppen mit N-(3-dimethylamino propyl) –N’-Ethyl Carbodiimide Hydrochlorid (EDC) und N– Hydroxysuccinimide (NHS). Die Hep-PEG-Mischung wurde dann durch Vernetzung der amino Ende funktionalisiert achtarmigen StarPEG (StarPEG-(NH2)8) und Heparin-NHS gebildet. Zur Insel Oberflächenbeschichtung waren Maus Inselchen über Kollagenase Verdauung und gradient Reinigung mit Histopaque isoliert. Isolierte Inseln wurden dann mit Eis kalt Hep-PEG-Lösung für 10 min kovalente Bindung zwischen NHS und Amin Gruppen der Insel Zellmembran ermöglichen behandelt. NanoCoatings mit Hep-PEG verursacht minimale Änderung Inselchen Größe und Volumen und Heparinisierung der Inseln mit Hep-PEG können auch sofort Blut-vermittelte entzündliche Reaktion während der inselversetzung verringern. Dieser “einfach zu erlassen” Ansatz ist ohne Kompromisse bei der Zellviabilität mild genug für Oberflächentechnik lebender Zellen. Wenn man bedenkt, dass Heparin Bindungsaffinität zu mehreren Zytokinen gezeigt hat, die Hep-PEG NanoCoatings auch bietet eine offene Plattform, die Einbeziehung der unbegrenzten funktionale biologische Mediatoren und vielschichtige Flächen für Wohnen ermöglicht Zelloberfläche Bioengineering.
Die therapeutische Wirksamkeit von zellbasierten Therapien wird durch niedrige Zelle Retention und Armen überleben1,2begrenzt. Um das Ergebnis von Zelltherapien verbessern, Zell-Oberflächentechnik durch enzymatische Manipulation, wurde Peptid Konjugation, Bioorthogonal Chemie und physikalischen Kapselung mit Biomaterialien ausgebeuteten3,4, 5,6,7,8,9,10. Das aktuelle Protokoll strebt Oberflächentechnik von lebenden Zellen mit einer “leicht zu erlassen” Methode durch die Anwendung einer ultradünnen Heparin enthalten StarPEG (Heparin-PEG) NanoCoatings auf der Zelloberfläche. Oberflächentechnik von Pankreas Inseln präsentierte sich hier als Beispiel aufgrund der Heterogenität der Langerhans-Inseln und die abfällige Ergebnisse der aktuellen klinischen inselversetzung.
In der Tat, klinischen inselversetzung erfolgt derzeit durch direkte Injektion von isolierten Inseln in die hepatische portalader und dieses Verfahren ist nur für ausgewählte Patienten wegen der Knappheit an Spender Materialien und geringe therapeutische Wirksamkeit 11. konventionell, Alginat wurde die am häufigsten verwendeten Biomaterial für Inselchen Kapselung und Oberflächenmodifikation, obwohl es aufgrund der chemischen Instabilität der Alginat und Fibrose im Zusammenhang mit entzündlichen12, weniger als ideal ist 13. Darüber hinaus sind im Vergleich zu der natürlichen Größe der Inseln, die zwischen 100 bis 200 µm, die Alginat-Inselchen Mikrokapseln größer, zwischen 400 und 800 µm, die überschreiten der physiologische diffundierende Entfernung von Sauerstoff. Winkeltreue Inselchen Kapselung, dh., Verkapselung Inseln ohne wesentliche Änderung des Inselchen Volumen, dann entwickelt wurde. So, Ablagerung von Nanomembranes bestehend aus PEG, Tetrafluorethylen, silikonmembrane oder mehrschichtige NanoCoatings (auch bekannt als die “Schicht für Schicht” [LBL] Technik) wurde berichtet, was zu verbesserter in-vitro- Insel überleben14 ,15,16,17,18, obwohl die LBL nähern oft erfordert umfangreiche Inselchen Übergabe Periode zur Abscheidung von mehreren Schichten, welche Insel Lebensfähigkeit gefährden können . Instabilität des Nanomembranes, von die abhängt, elektrostatische oder kovalente Wechselwirkungen zwischen Biomembran Schichten oder hydrophobe Wechselwirkungen zwischen Nanomembranes und der kleinen Insel Oberfläche wirft darüber hinaus auch Bedenken9,14 , 15 , 16 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26.
Ein weiterer begrenzender Faktor, der das therapeutische Ergebnis der intraportal inselversetzung überfüllt ist die sofortige Blut-vermittelte entzündliche Reaktion (IBMIR) verursacht durch direkten Kontakt der implantierten Inselchen mit Blut, wodurch die Thrombozytenaggregation, Koagulation und Immunsystem negativ oder unerwünschte zellulären Aktivierung9. Um diese Probleme zu beheben, wurde eine ultradünne NanoCoatings bestehend aus sternförmigen Polyethylenglykol (StarPEG) für seine etablierten Biokompatibilität und Vielseitigkeit als Gehäusematerial Insel vorbereitet. Heparin, eine höchst sulfatierte Glykosaminoglykan, wurde auch die StarPEG NanoCoatings für seine entzündungshemmende, Antigerinnungsmittel Eigenschaften und Fähigkeit, Vaskularisation zu erleichtern durch die Rekrutierung von Pro-angiogene Wachstumsfaktoren22enthalten, 23.
In diesem Artikel zeigen wir “einfach zu erlassen” Ansatz für lebende Zelle Oberflächentechnik ein Heparin-integriert StarPEG NanoCoatings über Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen den N– Hydroxysuccinimide die NanoCoatings und die Amin Gruppen des Pankreas Inselchen Oberfläche Membran. In der Tat die Aminogruppen in Zellmembranen sind hochreaktiv und infolgedessen frühere Studien haben berichtet, dass Wechselwirkungen zwischen primären Aminogruppen mit aktivierten N– Hydroxysuccinimidyl (NHS) Ester unter physiologischen Bedingungen14 ,16,21. Darüber hinaus hat umfangreiche Forschungen berichtet, dass Einbau von Heparin, ein höchst sulfatierte Glykosaminoglykan und wichtiger Bestandteil der extrazellulären Matrix, während Inselchen Kapselung zu verbesserten Posttransplantationsperiode führen könnte Revaskularisation und reduzierte IBMIR22,23. In Anbetracht der Biokompatibilität von PEG und mehrwertige Eigenschaften des Heparins haben wir 8-armigen PEG für maximale Heparin während der Fertigung der NanoCoatings Laden verwendet. Heparin wurde mit -NHS, modifiziert, die anschließend mit der -NH2 Gruppen auf Insel Zellmembran reagieren würde. Aktivieren die kovalente Bindung-Bildung -NH2 (der Zellmembran) bis -NHS die Hep-PEG, die Inseln leicht “beschichtet werden würde” durch die PEG Heparin eingearbeitet, wodurch es ein Nano-Dünnschicht (NanoCoatings) auf der äußeren Oberfläche des der Bauchspeicheldrüse Inselchen.
Der bisherige Ansatz unterscheidet sich von zuvor veröffentlichten Methoden, die auch PEG als die großen Polymer für Inselchen Mikroverkapselung in diesem Pseudo-Bioorthogonal Chemie zwischen -NHS (von NanoCoatings) und NH –2 von der inselzelle ausgewählt Membran diente. Wenn man bedenkt, dass die Stabilität der inselzelle/Beschichtung, vor allem in einem komplexen Umfeld wie das Plasma ist entscheidend für die Post-Transplantation Revaskularisation und überleben, die Bildung zwischen -NHS und -NH2 wäre stabiler im Vergleich zu hydrophobe Wechselwirkung zwischen PEG und Zellmembran24, elektrostatische Wechselwirkungen9,15,24,25,26 oder biologische Verbindung zwischen biotin Streptavidin-14.
Darüber hinaus erfordert Beschichtung Ansatz, der auch auf der LBL-Ansatz mit erweiterten Inselchen Umgang mit Zeit für multi-Layer Deposition14,16,25, der heutigen Technik beruht im Gegensatz zur kleinen Insel minimal Verarbeitung und sehr kurze Beschichtung Periode der isolierten Inseln. Diese beiden Faktoren sind nach Transplantation Inselchen überlebenswichtig, da Inselchen Lebensfähigkeit oft bereits kompromittierten folgenden Inselchen Isolation aufgrund von beschädigten ECM während der enzymatischen Verdauung ist. Eine Einschränkung des derzeitigen Konzepts ist jedoch, dass im Gegensatz zu LBL, über die Dicke der äußeren Beschichtung gesteuert werden könnte, durch eine Erhöhung oder Verringerung der Zahl der Abscheidung von Schichten, Dicke der Hep-PEG NanoCoatings vorerst zugeschnitten werden kann nicht.
Darüber hinaus aufgrund der milden Zustand wo chemische Reaktion zwischen -NHS und -NH2 stattfindet, der bisherige Ansatz für lebende Zelle gilt Oberflächentechnik nicht auf Pankreas Inseln, aber die meisten Zelltherapie beschränkt. Zusätzlich, wenn man bedenkt, dass Heparin bekannt ist, mit einer Reihe von Zytokinen und biologisch aktiven Molekülen interagieren, Hep-PEG NanoCoatings stellt auch eine offene Plattform, die das Potenzial zur Aufnahme von unbegrenzten biologische Mediatoren sowie Schnittstellen für komplexere Zelle Oberflächentechnik.
The authors have nothing to disclose.
Wir sind dankbar für die finanzielle Unterstützung der National Natural Science Funds of China (31770968) und Tianjin-Programm der Anwendung Forschungsgemeinschaft und Advanced Technology (17JCZDJC33400).
Reagent | |||
PBS | Hyclone | AAJ207798 | |
Streptozototin | Sigma | S0130 | |
Histopaque | Sigma | 10831 | |
RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 31800022 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000-044 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
Cell Dissociation Solution | GIBCO, by Life Technologies | 13150-016 | |
DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12800017 | |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8644 | |
488 phalloidin | Sigma | A12379 | |
CFSE | Sigma | 21888-25mg-F | |
Annexin V/PI apoptosis kit | Dojindo | AD10 | |
DAPI Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
Collagenase from Clostridium, Type XI | Sigma | C7657 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
NHS | Sigma-Aldrich | 56480 | |
EDC | Sigma-Aldrich | 3449 | |
8-armed PEG | J&K Scientific Ltd | 1685176 | |
FAM | Sigma-Aldrich | M041100 | |
5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester | Sigma-Aldrich | 21888 | |
KBr | J&K Scientific Ltd | 32036 | |
3-aminopropyl-triethoxysilane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
toluene | J&K Scientific Ltd | S-15497-20X | |
Live/dead staining kit | Biovision, US | K501 | |
BD MatrigelTM, basement membrane matrix, growth factor reduced | BD Bioscience | 354230 | |
Sodium chloride, 99.5% | J&K Scientific Ltd | 105864 | |
Potassium chloride, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 991468 | |
Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 988639 | |
Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent | J&K Scientific Ltd | 182158 | |
Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure | J&K Scientific Ltd | 128839 | |
Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis | J&K Scientific Ltd | 119370 | |
Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl2 | J&K Scientific Ltd | 21114 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | V900933 | |
Rat/Mouse Insulin ELISA kit | Millipore-linco | EZRMI-13K |