División ingeniería-TET2 enzima ADN químico-inducible Hydroxymethylation y remodelación epigenéticos

La metilación del ADN, en su mayoría se refiere a la adición de un grupo metilo a la posición del carbono 5 del citosina para formar 5-METILCITOSINA (5mC), es catalizada por la DNA metil-transferasa (DNMTs). 5mC actúa como una marca epigenética más importante en el genoma mamífero que a menudo las señales de represión transcripcional, la inactivación del X-cromosoma y transposon silenciamiento¹. La inversión de la metilación del ADN está mediada por la familia de proteínas diez elfos desplazamiento (TET). Enzimas de TET pertenecen al hierro (II) y 2-oxoglutarato dioxygenases dependiente que catalizan la oxidación sucesiva de 5mC 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5-carboxycytosine (5caC). Oxidación mediada por TET 5mC impone una capa adicional de control epigenético del genoma mamífero. El descubrimiento de TET ha despertado gran interés en el campo de la epigenético para desvelar las funciones biológicas de las proteínas del TET y sus 5hmC principales productos catalíticos. 5hmC no es sólo un intermedio durante el TET-mediada activa ADN desmetilación^2,3,4, pero también actúa como un establo epigenético marca^5,6,7,8 . Aunque hydroxymethylation de ADN es altamente correlacionado con la expresión génica y aberrante cambios en ADN hydroxymethylation se asocian con algunos trastornos humanos^9,10,11, las relaciones causales entre las modificaciones epigenéticas en el ADN y los fenotipos permanecen a menudo difíciles de establecer, que se puede atribuir parcialmente a la falta de una herramienta confiable con precisión agregar o quitar modificaciones de ADN en el genoma en definida temporal y espacial resolución.

Aquí divulgamos el uso de un epigenoma químicas inducibles remodelación herramienta (sidra) para superar el obstáculo que enfrentan los estudios de las relaciones causales entre ADN hydroxymethylation y gene la transcripción. El diseño se basa en el supuesto de que el dominio catalítico de TET2 (TET2CD) puede dividirse en dos fragmentos inactivos cuando se expresa en células de mamíferos y su función enzimática puede ser restaurado por un enfoque de dimerización químicamente inducible ( Figura 1A). Para establecer un sistema split-TET2CD, se seleccionaron seis sitios en TET2CD, compuesto de una región rica en Cys y un pliegue doble hebra β-helix (DSBH), sobre la base de una estructura cristalina divulgado del complejo TET2-ADN que carece de una complejidad baja región¹². Un gen sintético que codifica proteína inducible por la rapamicina dimerización módulo FK506 12 (FKBP12) y dominio de unión a rapamicina FKBP (FRB) del blanco mamífero de rapamicina^14,15, junto con un péptido auto Hendedoras T2A polipéptido secuencia^16,17, individualmente fue insertado en los sitios de fractura seleccionados en TET2CD. La selección de TET2 como nuestro destino de ingeniería se basa en las siguientes consideraciones. En primer lugar, somáticas mutaciones en TET2 con reducción concomitante de ADN hydroxymethylation se observan con frecuencia en desordenes humanos incluyendo desordenes mieloides y cáncer¹⁰, que proporciona información útil en sitios sensibles a evitarse para inserción. En segundo lugar, una gran parte del dominio catalítico TET2, particularmente la región de baja complejidad, es prescindible para la función enzimática¹², lo que nos permite diseñar un split-TET2 minimizado por modificaciones epigenéticas inducibles. Después de evaluar más de 15 construcciones, una construcción que exhiben restauración rapamicina-inducible más alto de su actividad enzimática en el sistema mamífero fue elegida y designada como sidra¹⁸. En este documento se describe el uso de sidra etiquetada mCherry inducible ADN hydroxymethylation y remodelación epigenéticos con rapamicina y presentan tres métodos para la validación de 5hmC mediada por la sidra de producción en un sistema celular modelo HEK293T.