Фермент инженерии Сплит TET2 для химико индуцибельной ДНК Hydroxymethylation и эпигеномные Ремоделирование
Summary
Представлены подробные протоколы для внедрения инженерных Сплит TET2 фермента (сидр) в клетки млекопитающих для химических hydroxymethylation индуцибильный ДНК и эпигеномные ремоделирования.
Abstract
Метилирование ДНК является стабильной и наследственные эпигеномные изменения в геноме млекопитающих и участвует в регуляции экспрессии генов для контроля клеточных функций. Реверсирование метилирование ДНК, или ДНК деметилирования, при посредничестве десять-одиннадцать транслокация (тет) белка семьи dioxygenases. Хотя широко сообщалось, что аномальные метилирование ДНК и деметилирования, связанные с пороки развития и рак, как эти эпигеномные изменения непосредственно вносить последующие изменения в ген выражение или болезнь прогрессии остается неясным, в основном из-за отсутствия надежных инструментов для точного добавления или удаления ДНК изменения в геноме определенным временным и пространственным разрешением. Чтобы преодолеть это препятствие, мы разработали Сплит TET2 фермента для включения временного контроля 5-метилцитозин (5мс) окисления и последующей реконструкции эпигеномные государств в mammalian клетках простым добавлением химических веществ. Здесь мы описываем методы для введения химико индуцибельной epigenome ремоделирования инструмент (сидр), основанный на инженерных Сплит TET2 фермента, в клетках млекопитающих и количественного химического индуцибельной производство 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC) с иммуноокрашивания, проточной цитометрии или пробирного дот блот. Этот химико индуцибельной epigenome ремоделирования инструмент найдет широкое применение в допросе сотовых систем без изменения генетического кода, а также зондирующего epigenotype−phenotype отношений в различных биологических систем.
Introduction
Метилирование ДНК, главным образом относится к добавлением метильной группы углерода 5 позицию цитозина сформировать 5-метилцитозин (5мс), катализируемые ДНК метил трансферазы (DNMTs). 5мс выступает в качестве основных эпигеномные Марк в геноме млекопитающих, который часто сигнализирует транскрипционный анализ репрессий, инактивации х и глушителей1transposon. Реверсирование метилирование ДНК при посредничестве десять Эльфийская транслокация (тет) белка семьи. ТЕТ ферментов принадлежат железа (II) и 2-oxoglutarate зависит от dioxygenases, которые катализируют последовательных окисления 5мс 5-Гидроксиметилцитозин (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) и 5-carboxycytosine (5caC). ТЕТ опосредованной 5мс окисления накладывает дополнительный слой эпигеномные контроля над геном млекопитающих. Открытие тет вызвал повышенный интерес в области эпигеномные раскрыть биологические функции тет белков и их основных продуктов каталитического 5hmC. 5hmC является не только промежуточным во время тет опосредованной ДНК деметилирования active2,3,4, но также действует как эпигеномные стабильной Марк5,6,7,8 . Хотя ДНК hydroxymethylation отличается высокой корреляцией с экспрессии генов и аномальные изменения в ДНК hydroxymethylation связаны с некоторыми человека расстройств9,10,11, причинно-следственных отношений эпигеномные изменения на ДНК и фенотипы часто остаются сложной должен быть создан, который частично может объясняться отсутствием надежного инструмента точно добавить или удалить модификации ДНК генома на определенных временных и пространственных резолюции.
Здесь мы приводим использование химико индуцибельной epigenome Ремоделирование инструмент (сидр) для преодоления препятствий, стоящих перед исследования причинно-следственных связей между hydroxymethylation и Джин транскрипция ДНК. Дизайн основан на предположении что каталитического домен TET2 (TET2CD) может быть разделен на две неактивные фрагментов при выраженных в mammalian клетках и ферментативные функции может быть восстановлена на основе химически индуцибельной димеризации подхода ( Рисунок 1A). Создать систему Сплит TET2CD, мы выбрали шесть мест в TET2CD, состоящий из региона богатые Cys и складку двунитевая β-спираль (DSBH), на основе сообщенных Кристаллическая структура комплекса TET2-ДНК, что не хватает низкой сложности региона12. Синтетический ген кодирования rapamycin индуцибельной димеризации модуль FK506 связывания белка 12 (FKBP12) и FKBP rapamycin связывающий домен (FRB) млекопитающих цель rapamycin14,15, наряду с самостоятельной расщепления пептидов T2A Полипептид последовательности16,17, индивидуально был вставлен в выбранной Сплит сайтов в TET2CD. Выбор TET2 в качестве нашей инженерной целевой основывается на следующих соображениях. Во-первых, соматические мутации в TET2 с сопутствующей снижением ДНК hydroxymethylation часто наблюдаются в человека расстройств, включая миелоидного расстройств и рака10, который обеспечивает полезную информацию на чувствительных участках следует избегать для вставки. Во-вторых большая часть TET2 катализатора домена, особенно низкой сложности региона, является необязательным для ферментативные функции12, что позволило нам выработать свернутого Сплит TET2 индуцибильный эпигеномные изменения. После проверки более 15 конструкций, конструкции, которые выставлены высоким rapamycin индуцибельной восстановление ферментативной активности в системе млекопитающих был выбран и назначил сидр18. Мы здесь описывают использование mCherry тегами сидр достичь индуцибельной ДНК hydroxymethylation и эпигенетические ремоделирования с rapamycin и представить три метода для проверки сидр опосредованной 5hmC производства в системе сотовой модели HEK293T.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы продемонстрировали использование инженерных Сплит TET2 фермента для достижения временной контроль над hydroxymethylation ДНК. После открытия тет семьи 5-methycytosine dioxygenase многие исследования были проведены расшифровать биологические функции тет белков и их основных продуктов каталитичес?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим финансовой поддержки от национальных институтов здравоохранения Грант (R01GM112003 YZ), Фондом Уэлч (BE-1913 до YZ), американского общества рака (RSG-16-215-01 КЭ в YZ), профилактики рака и исследовательский институт штата Техас (RR140053 для YH, RP170660 для YZ), Американская ассоциация сердца (16IRG27250155 для YH) и Джон S. Dunn фонд программы совместных исследований премии.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
References
- Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
- Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
- Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
- Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
- Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
- Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
- Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
- Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
- Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
- Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).
