Un enzima Split-TET2 ingegnerizzati per chimica-inducible DNA Hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico

Metilazione del DNA, per lo più l’aggiunta di un gruppo metile in posizione del carbonio 5 della citosina per formare la 5-metilcitosina (5mC) si riferisce, è catalizzata dalla DNA metil-transferasi (DNMTs). 5mc agisce come un segno importante epigenetico nel genoma dei mammiferi che spesso i segnali per la repressione trascrizionale, inattivazione del cromosoma x e trasposoni silenziamento¹. L’inversione di metilazione del DNA è mediata dalla famiglia delle proteine di traslocazione (TET) Ten-elfico. Gli enzimi TET appartengono al ferro (II) e 2-ossoglutarato dipendenti diossigenasi che catalizzano l’ossidazione successivo di 5mC 5-idrossimetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) e 5-carboxycytosine (5caC). TET-mediata 5mC ossidazione impone un ulteriore livello di controllo epigenetico sopra il genoma dei mammiferi. La scoperta del TET ha suscitato interesse intenso nel campo epigenetico di svelare le funzioni biologiche delle proteine TET e loro 5hmC catalitica dei principali prodotti. 5hmC non è solo un intermedio durante il TET-mediata attivo DNA demetilazione^2,3,4, ma anche atti come stalla epigenetica mark^5,6,7,8 . Anche se hydroxymethylation del DNA è altamente correlato con l’espressione genica e aberrante cambiamenti nel DNA hydroxymethylation sono associati con alcuni disordini umani^9,10,11, i rapporti di causalità tra le modifiche epigenetiche sul DNA e i fenotipi rimangono spesso difficile da stabilire, che può essere parzialmente attribuita alla mancanza di strumento affidabile con precisione aggiungere o rimuovere modifiche del DNA nel genoma presso definito temporale e spaziale ad alta risoluzione.

Qui segnaliamo l’uso di una prodotto chimico-inducible epigenome rimodellamento strumento (sidro) per superare l’ostacolo di fronte gli studi delle relazioni causali tra trascrizione del DNA hydroxymethylation e gene. Il design è basato sul presupposto che il dominio catalitico di TET2 (TET2CD) può essere diviso in due frammenti inattivi quando espresso in cellule di mammifero e sua funzione enzimatica può essere ripristinato attraverso un approccio di dimerizzazione chimicamente inducibile ( Figura 1A). Per stabilire un sistema di Spalato-TET2CD, abbiamo selezionato sei siti in TET2CD, composto di una regione ricca di Cys e una piega doppia elica β-elica (DSBH), sulla base di una struttura di cristallo segnalati di TET2-DNA complesso che manca di una regione di bassa complessit๲. Un gene sintetico che codifica la proteina rapamicina-inducible dimerizzazione modulo FK506 12 (FKBP12) e dominio di legame di rapamicina FKBP (FRB) dell’obiettivo mammifero della rapamicina^14,15, insieme a un peptide self-che fende T2A polipeptide sequenza^16,17, singolarmente è stato inserito nei siti selezionati di Spalato all’interno di TET2CD. La selezione di TET2 come nostro obiettivo engineering si basa sulle seguenti considerazioni. Mutazioni somatiche, prime TET2 con concomitante riduzione del DNA hydroxymethylation sono osservate frequentemente in disordini umani tra cui disordini mieloidi e cancro¹⁰, che fornisce informazioni utili su siti sensibili deve essere evitato per inserimento. In secondo luogo, non una grande frazione di TET2 dominio catalitico, specialmente la regione di bassa complessità, è indispensabile per la funzione enzimatica¹², consentendoci così di una split-TET2 minimizzato per modificazioni epigenetiche viscoelastiche del mestiere. Dopo lo screening oltre 15 costrutti, un costrutto che ha esibito più alto rapamicina-inducible restauro della sua attività enzimatica nel sistema mammifero è stato scelto e designato come sidro¹⁸. Qui descriviamo l’uso di sidro mCherry-etichetta per raggiungere viscoelastica DNA hydroxymethylation e rimodellamento epigenetico con rapamicina e presentiamo tre metodi per la convalida di produzione 5hmC sidro-mediata in un sistema cellulare modello HEK293T.