Een gemanipuleerde Split-TET2 enzym voor chemische-afleidbare DNA Hydroxymethylation en epigenetische Remodeling
Summary
Gedetailleerde protocollen voor de invoering van een gemanipuleerde split-TET2 enzym (appelwijn) in zoogdiercellen voor chemische afleidbare DNA-hydroxymethylation en epigenetische remodeling worden gepresenteerd.
Abstract
Methylation van DNA is een stabiele en erfelijke epigenetische wijziging in het genoom van zoogdieren en is betrokken bij de regulering van de genexpressie om cellulaire functies. De omkering van methylation van DNA en DNA demethylatie, is bemiddeld door de tien-elf translocatie (TET) eiwit familie van dioxygenases. Hoewel het is wijd gemeld dat aberrant methylation van DNA en demethylatie geassocieerd met ontwikkelingsstoornissen gebreken en kanker zijn, hoe deze epigenetische veranderingen dragen rechtstreeks bij aan de latere wijziging in gen expressie of ziekte progressie blijft onduidelijk, grotendeels als gevolg van het gebrek aan betrouwbare instrumenten nauwkeurig toevoegen of verwijderen van DNA wijzigingen in het genoom bij gedefinieerde temporele en ruimtelijke resolutie. Om te overwinnen deze hindernis, ontwierpen we een split-TET2 enzym om de temporele controle van oxidatie van de 5-methylcytosine (5mC) en de daaropvolgende remodeling van epigenetische Staten in zoogdiercellen door simpelweg toevoegen van chemicaliën. Hier beschrijven we methoden voor de invoering van een chemische stof-afleidbare epigenome remodelleert tool (appelwijn), gebaseerd op een gemanipuleerde split-TET2 enzym, in zoogdiercellen en kwantificeren van de chemische afleidbare productie van 5-hydroxymethylcytosine (5hmC) met immunokleuring, stroom cytometry of een dot-blot test. Deze chemische-afleidbare epigenome remodelleert tool vindt brede gebruik in het ondervragen van cellulaire systemen zonder te veranderen van de genetische code, evenals in het sonderen van de epigenotype−phenotype betrekkingen in verschillende biologische systemen.
Introduction
Methylation van DNA, meestal verwijst naar de toevoeging van een methylgroep naar de koolstof 5 positie van cytosine te vormen 5-methylcytosine (5mC), wordt gekatalyseerd door DNA methyl-transferasen (DNMTs). 5mC fungeert als een grote epigenetische mark in de zoogdieren genoom die vaak signalen voor transcriptionele onderdrukking, x-chromosoom inactivering en transposon silencing1. De omkering van methylation van DNA wordt gemedieerd door de tien-elven translocatie (TET) eiwit-familie. TET enzymen behoren tot de ijzer (II) en de afhankelijke dioxygenases 2-oxoglutarate, die de opeenvolgende oxidatie van 5mC 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) en 5-carboxycytosine (5caC) katalyseren. 5mC TET-gemedieerde oxidatie legt een extra beveiligingslaag epigenetische controle over het genoom van zoogdieren. De ontdekking van TET heeft gevonkt intense belangstelling in de epigenetische veld te onthullen van de biologische functies van TET eiwitten en hun grote katalytische product 5hmC. 5hmC is niet alleen een intermediair tijdens TET-gemedieerde actieve DNA demethylatie2,3,4, maar ook fungeert als een stabiele epigenetische mark5,6,7,8 . Hoewel de DNA-hydroxymethylation is sterk gecorreleerd met genexpressie en afwijkende veranderingen in DNA hydroxymethylation worden geassocieerd met sommige menselijke aandoeningen9,10,11, de causale relaties tussen de epigenetische veranderingen op DNA en de fenotypes blijven vaak uitdagend om te worden vastgesteld, die deels kan worden toegeschreven aan het ontbreken van betrouwbare hulpmiddel om nauwkeurig wijzigingen toevoegen of verwijderen DNA in het genoom bij gedefinieerd temporele en ruimtelijke resolutie.
Wij rapporteren hier het gebruik van een chemische stof-afleidbare epigenome remodelleren gereedschap (appelwijn) te overwinnen de hindernis tegenover studies van causale relaties tussen DNA-hydroxymethylation en gene transcriptie. Het ontwerp is gebaseerd op de veronderstelling dat het katalytische domein van TET2 (TET2CD) kan worden gesplitst in twee inactief fragmenten als uitgedrukt in zoogdiercellen en de enzymatische functie kan worden hersteld door een chemisch afleidbare dimerisatie benadering ( Figuur 1A). Systeem in te stellen een split-TET2CD, wij zes locaties geselecteerd in TET2CD, samengesteld uit een Cys-rijke regio en een double-stranded β-helix (DSBH) vouwen, op basis van een gerapporteerde kristalstructuur van TET2-DNA-complex dat een lage complexiteit regio12ontbreekt. Een synthetische gen codering rapamycin-afleidbare dimerisatie module FK506 bindend-proteïne 12 (FKBP12) en FKBP rapamycin bindend domein (FRB) van de zoogdieren streefcijfer van rapamycin14,15, samen met een zelf verbrijzelen peptide T2A polypeptide reeks16,17, werd individueel ingevoegd in de geselecteerde split sites binnen TET2CD. De selectie van TET2 als onze engineering doel is gebaseerd op de volgende overwegingen. Eerste, somatische mutaties in TET2 met gelijktijdige afname DNA hydroxymethylation worden vaak waargenomen bij menselijke aandoeningen waaronder myeloïde aandoeningen en kanker10, die nuttige informatie op gevoelige plaatsen te vermijden voor inbrengen. Ten tweede, een groot gedeelte van het katalytische domein van TET2, met name de lage complexiteit regio, is overbodig voor de enzymatische functie12, waardoor ons om een geminimaliseerde split-TET2 voor afleidbare epigenetische aanpassingen ambacht. Na het screenen van meer dan 15 constructies, was een constructie die hoogste rapamycin-afleidbare herstel van de enzymatische activiteit tentoongesteld in de zoogdieren systeem gekozen en CiDER18uitgeroepen. We beschrijven hierin het gebruik van mCherry-gelabeld CiDER tot afleidbare DNA hydroxymethylation en epigenetische remodelleren met rapamycin, en presenteren van drie methoden voor het valideren van CiDER-gemedieerde 5hmC productie in een model cellulaire systeem HEK293T.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we laten zien dat het gebruik van een gemanipuleerde split-TET2 enzym om de temporele controle van DNA-hydroxymethylation. Na de ontdekking van TET familie van 5-methycytosine-dioxygenase, te ontcijferen van de biologische functies van TET eiwitten en hun grote katalytische product 5hmC1,2,3, tal van studies hebben verricht 4,5,<sup cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de financiële ondersteunt van het National Institutes of Health verlenen (R01GM112003 naar YZ), de Stichting Welch (BE-1913 naar YZ), de American Cancer Society (RSG-16-215-01 TBE aan YZ), de kankerpreventie en Research Institute of Texas (RR140053 naar YH, RP170660 naar YZ), de American Heart Association (16IRG27250155 naar YH), en het programma van de toekenning van het onderzoek in samenwerkingsverband van John S. Dunn Foundation.
Materials
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | |
| Rapamycin | Sigma-Aldrich | 37094 | |
| Paraformaldehyde, 16% Solution | VWR | 100503-916 | |
| Triton X-100 | Amresco | 0694-1L | |
| Hydrochloric Acid | Amresco | 0369-500ML | |
| Albumin, Bovine | Amresco | 0332-100G | |
| Tween 20 | Amresco | 0777-1L | |
| 5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) antibody (pAb) | Active Motif | 39769 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11008 | |
| 4,6-Diamidino-2-phenylindolde (DAPI) | Biotium | 40043 | |
| SVAC1E SHEL LAB Economy Vacuum Oven, 0.6 Cu.Ft. (17 L) | SHEL LAB | SVAC1E | |
| UltraPure SSC, 20X | Thermo Fisher Scientific | 15557036 | |
| Bio-Dot Apparatus | BIO-RAD | 1706545 | |
| Anti-5-methylcytosine (5mC) Antibody, clone 33D3 | Millipore | MABE146 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7074S | |
| West-Q Pico Dura ECL Solution | Gendepot | W3653-100 |
References
- Li, E., Zhang, Y. DNA methylation in mammals. Cold Spring Harbor Perspectv Biol. 6 (5), a019133 (2014).
- Tahiliani, M., et al. Conversion of 5-methylcytosine to 5-hydroxymethylcytosine in mammalian DNA by MLL partner TET1. Science. 324 (5929), 930-935 (2009).
- He, Y. F., et al. Tet-mediated formation of 5-carboxylcytosine and its excision by TDG in mammalian DNA. Science. 333 (6047), 1303-1307 (2011).
- Ito, S., et al. Tet proteins can convert 5-methylcytosine to 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine. Science. 333 (6047), 1300-1303 (2011).
- Spruijt, C. G., et al. Dynamic readers for 5-(hydroxy)methylcytosine and its oxidized derivatives. Cell. 152 (5), 1146-1159 (2013).
- Lio, C. W., et al. Tet2 and Tet3 cooperate with B-lineage transcription factors to regulate DNA modification and chromatin accessibility. eLife. 5, e18290 (2016).
- Kellinger, M. W., et al. 5-formylcytosine and 5-carboxylcytosine reduce the rate and substrate specificity of RNA polymerase II transcription. Nat Struct Mol Biol. 19 (8), 831-833 (2012).
- Su, M., et al. 5-Formylcytosine Could Be a Semipermanent Base in Specific Genome Sites. Angew Chem Int Ed Engl. 55 (39), 11797-11800 (2016).
- Ko, M., et al. Impaired hydroxylation of 5-methylcytosine in myeloid cancers with mutant TET2. Nature. 468 (7325), 839-843 (2010).
- Huang, Y., Rao, A. Connections between TET proteins and aberrant DNA modification in cancer. Trends Genet. 30 (10), 464-474 (2014).
- Lu, X., Zhao, B. S., He, C. TET family proteins: oxidation activity, interacting molecules, and functions in diseases. Chem Rev. 115 (6), 2225-2239 (2015).
- Hu, L., et al. Crystal structure of TET2-DNA complex: insight into TET-mediated 5mC oxidation. Cell. 155 (7), 1545-1555 (2013).
- Hashimoto, H., et al. Structure of a Naegleria Tet-like dioxygenase in complex with 5-methylcytosine DNA. Nature. 506 (7488), 391-395 (2014).
- Banaszynski, L. A., Liu, C. W., Wandless, T. J. J. Characterization of the FKBP.rapamycin.FRB ternary complex. J Am Chem Soc. 127 (13), 4715-4721 (2005).
- Clackson, T., et al. Redesigning an FKBP-ligand interface to generate chemical dimerizers with novel specificity. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (18), 10437-10442 (1998).
- Ibrahimi, A., et al. Highly efficient multicistronic lentiviral vectors with peptide 2A sequences. Hum Gene Ther. 20 (8), 845-860 (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLoS One. 6 (4), e18556 (2011).
- Lee, M., et al. Engineered Split-TET2 Enzyme for Inducible Epigenetic Remodeling. J Am Chem Soc. 139 (13), 4659-4662 (2017).
- Huang, Y., Pastor, W. A., Zepeda-Martínez, J. A., Rao, A. The anti-CMS technique for genome-wide mapping of 5-hydroxymethylcytosine. Nat Protoc. 7 (10), 1897-1908 (2012).
- Buenrostro, J. D., Wu, B., Chang, H. Y., Greenleaf, W. J. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide. Curr Protoc Mol Biol. 109 (21.29), 1-9 (2015).
