Захват кинетика взаимодействия ионного канала белка с малых молекул в Assay интерферометрии био слоя
Summary
Протокол описывает взаимодействие очищенный hEAG1 ионный канал белка с маленькой молекулы липидов лигандом фосфатидилинозитол 4, 5-Бисфосфат (пункт2). Измерения демонстрирует, что BLI может быть потенциальным методом для Роман мелкомолекулярных ионного канала лигандом скрининга.
Abstract
Био слоя пробирного интерферометрии (BLI) является ценным инструментом для измерения протеин протеина и молекулы белка маленький взаимодействий. Здесь, мы сначала описать применение этот роман метки бесплатно технику для изучения взаимодействия человеческого EAG1 (hEAG1) белки канал с маленькой молекулы PIP2. hEAG1 канал был признан потенциальных терапевтических цели из-за его аномальным гиперэкспрессия в несколько мутаций усиления функции участвуют в некоторых видах неврологических заболеваний и рака. Мы очищенной hEAG1 канал белки от системы млекопитающих стабильной выражение и измерить взаимодействие с2 PIP, BLI. Успешного измерения кинетики привязки между hEAG1 белка и ПУМ2 показывает, что BLI assay потенциал высок объём подход, используемый для Роман малые молекулы лиганда скрининга в фармакологии ионного канала.
Introduction
Ориентация клеток поверхности доступные ионного канала белков с малых молекул предлагает огромный потенциал для скрининга лиганда и биологических наркотиков открытие1,2,3. Таким образом соответствующий инструмент необходим для изучения взаимодействия между ионного канала и малых молекул и их соответствующие функции. Патч зажим запись была продемонстрирована быть уникальной и незаменимой техники в ионных каналов функциональных assay. Однако, определение ли малые молекулы предназначены непосредственно для ионных каналов требуют других технологий. Традиционно радиоактивных лигандом привязки был использован соблюдать кинетика привязки между малые молекулы и его целевого белка ионного канала. Однако использование этой техники является ограниченным из-за его требование радиоактивных маркировки и обнаружения. Кроме того предварительные шаг для обозначения мелких лиганд в исследовании предотвращает его использование во многих типах ионных каналов без известных конкретных лиганда. Некоторые метки бесплатные методы, такие как ЯМР спектроскопии, рентгеновской дифракции, микромасштабной thermophoresis (MST)4 и поверхностного плазмон резонанса (СРП) были использованы для оценки взаимодействия молекулы белка маленький. Но эти виды анализов обычно не может предоставить достаточно информации из-за трудности, чтобы получить полноценный белок, низкое разрешение, динамики, низкой пропускной способности и высокой стоимостью5. В отличие от этих методов био слоя интерферометрии (BLI) формируется как Роман метки бесплатно методология для преодоления этих недостатков для обнаружения взаимодействия молекулы белка маленький иммобилизирующие небольшое количество белка образца на поверхностях Биосенсор и измерительные оптические изменения сигналов6,7. Как перспективной платформой биосенсор, BLI техника уже выполняется наблюдать взаимодействие малых молекул с природной водой растворимые белки такие человеческие моноклональные антитела CR80208 и подробного анализа процедуры уже сообщалось в предыдущие статьи9. Хотя была признана ключевая роль ионного канала белка для обнаружения новых терапевтических целей, ионного канала молекулы белка маленький взаимодействия assay основанный на BLI не были описаны.
Человека эфира меню go-go каналов (hEAG1), выраженные в различных типов раковых клеток и центральной нервной системы, что делает канал a потенциальных терапевтических цели многих раковых заболеваний и нейрональных расстройств10,11, 12,,1314. Электрофизиологическое исследование в нашей лаборатории подтвердил тормозящий эффект фосфатидилинозитол 4, 5-Бисфосфат (пункт2) на hEAG1 канал15. На основе наших результатов, тестирование PIP2 непосредственное взаимодействие с hEAG1 с помощью BLI техника может быть как модель для других типов ионного канала молекулы белка маленький составные взаимодействия специально для этих каналов не хватает конкретных лигандами. Согласно указаниям BLI пробирного, мы подготовили биотинилированным hEAG1 белков и иммобилизованные их на поверхности стрептавидина (SA) биосенсор советы следуют взаимодействия их пункта2 решения соблюдать их прямую привязку между белков и липидов. После вложения PIP2 hEAG1 белка с покрытием поверхности, толщина слоя на поверхности увеличивается, который напрямую коррелирует сдвиг спектральных и может быть измерена в режиме реального времени16. Кинетика привязки может быть определен из-за позитивный сдвиг в ассоциации шаг и отрицательный сдвиг в диссоциации шаг. Согласно этому принципу мы очищенный белок канала Ион функциональные hEAG1 ГЭС 239T выражение стабильной системы, используя метод очищения сродства для поддержания в vitro функционального состояния, а затем Измеренная кинетика привязки различные концентрации пункта2и принесли semblable кинетических данных, как отмечено в электрофизиологические измерения15. Тесная связь между результатами от BLI и электрофизиологические измерения в первый раз продемонстрировать пригодность BLI как соответствующий аналитический инструмент для ионного канала мембраны молекулы белка маленький взаимодействия.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как основной терапевтических целей более чем на 13% в настоящее время известные препараты для лечения различных заболеваний человека, в том числе сердечно-сосудистой системы и неврологических расстройств18были проверены мембранных ионных каналов. Патч зажим записи, золото…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана центр био-ID и SJTU кросс-дисциплинарной Фонд исследований в области медицины и техники (YG2016QN66), Национальный фонд естественных наук Китая (31271217) и национальных базовых исследований программа Китая (2014CB910304).
Materials
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
- Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
- Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
- Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
- Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
- Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
- Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
- Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
- Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
- Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
- Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?. Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).
