Capturando a cinética de interação de uma proteína de canal iônico com pequenas moléculas por ensaio de interferometria de Bio-camada

Como alvo as proteínas de canal de íon superfície acessível de célula com pequenas moléculas oferece um enorme potencial para a triagem de ligante e descoberta de drogas biológicas a^1,2,3. Assim, um instrumento adequado é necessário para estudar a interação entre o canal iônico e pequenas moléculas e sua função correspondente. A gravação da remendo-braçadeira tem demonstrada para ser uma técnica única e insubstituível em ensaio funcional de canal de íon. No entanto, determinar se as pequenas moléculas alvo diretamente canais iônicos exigir outras tecnologias. Tradicionalmente, o ensaio de ligação do ligante radioativo foi usado para observar a cinética de ligação entre pequenas moléculas e sua proteína de canal de íon do alvo. No entanto, o uso desta técnica é limitado por causa de sua exigência em etiquetar radioativo e deteção. Além disso, a etapa pré-requisito para rotular o ligante pequeno no estudo impede seu uso em muitos tipos de canais iônicos sem ligante específico conhecido. Algumas técnicas de etiqueta livre tais como espectroscopia NMR, difração de raios x, microescala thermophoresis (MST)⁴ e ressonância de plasmon de superfície (SPR) tem sido usadas para medir as interações da proteína-pequena molécula. Mas esses tipos de ensaios geralmente não podem fornecer informações suficientes por causa da dificuldade para obter a proteína completo, baixa resolução de dinâmica, baixa taxa de transferência e de alto custo⁵. Em contraste com estas técnicas, bio-camada interferometria (BLI) está emergindo como uma metodologia romance livre de rótulo para superar estas desvantagens para detecção de interações proteína-pequena molécula por imobilizando um pequenas quantidades de amostra de proteína nas superfícies das Biosensor e medir a mudança da ótica sinais^6,7. Como uma plataforma de biosensor promissor, técnica BLI já é realizada para observar a interação de moléculas pequenas com água natural proteínas solúveis como um anticorpo monoclonal humano CR8020⁸ e o procedimento de ensaio detalhado tem sido relatado em uma anterior artigo⁹. Embora o papel fundamental da proteína de canal de íon para descoberta de novos alvos terapêuticos tem sido reconhecido, o ensaio de interação molécula de proteína-pequeno de canal íon baseado em BLI não foi descrito.

O ser humano canais éter à go-go (hEAG1) são expressos em vários tipos de células cancerosas e sistema nervoso central, que faz com que o canal um potencial alvo terapêutico de muitos cancros e distúrbios neuronal^{10,11, 12,13,14}. O estudo eletrofisiológico em nosso laboratório confirmou o efeito inibitório de fosfatidilinositol 4, 5-bisfosfato (PIP₂) do hEAG1 canal¹⁵. Com base em nossos resultados, teste PIP₂ diretamente a interação com o hEAG1, usando a técnica BLI pode ser como um modelo para outros tipos de interação composto de íon canal molécula de proteína-pequeno especialmente para esses canais sem ligantes específicos. De acordo com as instruções de ensaio BLI, estamos preparados biotinilado hEAG1 proteínas e imobilizado-los na superfície do streptavidin (SA) dicas biosensor seguiram de interação-os para soluções de₂ PIP para observar sua vinculação direta entre o proteínas e os lipídios. Após a fixação do PIP₂ para hEAG1 a superfície revestida de proteína, a espessura da camada na superfície aumenta, que diretamente correlaciona o deslocamento espectral e pode ser medido em tempo real¹⁶. A cinética de ligação pode ser determinada devido a uma mudança positiva na etapa de associação e uma mudança negativa na etapa da dissociação. De acordo com este princípio, nós purificado da proteína de canal de íon hEAG1 funcional de HEK-239T expressão estável sistema usando o método de purificação de afinidade para manter o estado funcional in vitro , em seguida, medido a cinética de ligação de concentração diferente PIP₂e rendeu um semblable dados cinéticos, como observado em medidas eletrofisiológicas¹⁵. A estreita correspondência entre os resultados do BLI e medições eletrofisiológicas demonstram pela primeira vez a adequação do BLI como uma ferramenta analítica adequada para interação de molécula de proteína-pequeno membrana do canal de íon.