バイオ層干渉法による小分子とイオン チャネル蛋白質の相互作用の動力学をキャプチャ
Summary
ここのプロトコルでは、小分子脂質リガンド ホスファチジルイノシトール 4, 5-ビスリン酸 (PIP2) と精製 hEAG1 イオン チャネル蛋白質の相互作用について説明します。測定は、バリでした小分子イオン チャネル リガンドのスクリーニングのための潜在的な方法であることを示します。
Abstract
バイオ層干渉 (結合) アッセイは、タンパク質とタンパク質・小分子相互作用を測定するための貴重なツールです。ここでは、まず人間の EAG1 の相互作用を研究する新ラベル無料技術のアプリケーションを示す低分子 PIP2(hEAG1) チャネル蛋白質。hEAG1 チャネルは、がんや神経疾患のいくつかの種類に関与するいくつかの機能獲得変異でその異常発現のための潜在的な治療上のターゲットとして認識されています。我々 は哺乳類の安定発現系から hEAG1 チャネル蛋白質を精製し、PIP2バリとの相互作用を測定します。HEAG1 タンパク質と PIP2間のバインドの動態の測定に成功は、バリ アッセイであるイオン チャネルの薬理学の新規低分子リガンドのスクリーニングに使用可能性のある高スループット アプローチについて説明します。
Introduction
ターゲット小分子と細胞表面でアクセス可能なイオン チャネル蛋白質リガンドのスクリーニングと生物学的製剤の発見1,2,3の途方もない可能性を提供しています。したがって、適切なツールは、イオン チャネルおよび小さい分子および彼らの対応する関数との相互作用に必要です。パッチ ・ クランプ記録は、イオン チャネル機能アッセイにユニークでかけがえのない技術実証されています。ただし、他の技術を必要とする小さな分子がイオン チャネルを直接対象かどうかを決定します。伝統的に、放射性リガンド結合アッセイ法はイオン チャネル タンパク質・小分子間結合の動態を観察していました。ただし、この技法の使用法は、限られたその要件を満たすのため放射性分類および検出。また、研究で小さなリガンドのラベルに必須のステップは知られている特定のリガンドなしイオン チャネルの多くの種類で使用できなくなります。NMR 分光法、x 線回折、マイクロ スケール働く (MST)4表面プラズモン共鳴 (SPR) などいくつかの無料のラベルのテクニックは、小さなタンパク質分子間相互作用を測定するために使用されています。しかし、通常の試金のこれらのタイプは、実物大の蛋白質、ダイナミクス、低いスループット、および高コスト5の低解像度を得ることが困難なのため十分な情報を提供できません。これらの手法とは対照的バイオ層干渉 (結合) の表面の小さな蛋白質のサンプル量を固定化した小さなタンパク質分子間相互作用を検出するためのこれらの欠点を克服するための新しいラベル無料方法論として浮上しています。バイオ センサーと光の変化を測定、6、7を通知します。有望なバイオ センサー プラットフォームとしてのバリの方法を既に実行してひと抗体 CR80208などの可溶性タンパク質の天然水で小さな分子の相互作用を観察して、詳細な試金プロシージャで報告されている、前9条。新しい治療上のターゲット発見のためイオン チャネル蛋白質の重要な役割が認識されているがバリに基づくイオン チャネル蛋白質小分子の相互作用アッセイは記載されていません。
人間ゴーゴー エーテル アラカルトチャンネル (hEAG1) は癌細胞および多くのがんや神経疾患10、11、チャネルの潜在的な治療ターゲットとなる中枢神経系の様々 な種類で表されます。 12,13,14。私たちの研究室で電気生理学的調査は、ホスファチジルイノシトール 4, 5 ビスリン酸 (PIP2) hEAG1 チャネル15の抑制効果を確認しました。テスト PIP2バリ手法による hEAG1 との相互作用は特に特定のリガンドを欠けているこれらのチャネルのイオン チャネル蛋白質小分子化合物相互作用の他のタイプのためのモデルとしてすることができます直接私たちの結果に基づいています。バリ アッセイの指示に従って我々 は hEAG1 蛋白質ビオチン化を準備し、それらを固定化したストレプトアビジン (SA) の表面にバイオ センサーのヒント続く相互作用それら PIP2ソリューションとの間の直接結合を観察するために、蛋白質および脂質。HEAG1 タンパク質表面、表面の層の厚さに PIP2の添付ファイルが増加した後直接相関スペクトルのシフトとリアルタイム16で測定することができます。拘束運動は、協会ステップで正のシフトと解離の手順で負のシフトにより決定できます。この原則によると我々 は体外機能的状態を維持するために親和性の浄化法を用いた HEK 239T 安定発現システムから機能的な hEAG1 イオン チャネル蛋白質を精製し、結合の動態を測定濃度の異なる2、ピップし、電気生理学的測定15に見られる semblable 速度論的データが得られました。バリからの結果と電気生理学的測定との間に対応は初めてイオン チャンネル膜蛋白質小分子相互作用の適切な分析ツールとしてのバリの適性を示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
膜イオン チャネルは、さまざまな心血管および神経学的疾患18を含む人間の病気の治療のため現在知られている医薬品の 13% 以上の主要な治療上のターゲットとして検証されています。パッチ ・ クランプ記録、小分子とイオン チャネルの機能を測定するため黄金の標準は、広くイオン チャネル リガンドのスクリーニングに使用されています。ただし、小さな分子は他の蛋…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、バイオ ID センターと医学と工学 (YG2016QN66)、国家自然科学基金、中国の (31271217)、および基本的な研究プログラムの中国国家 (2014CB910304) では上海交通大学横断的研究費によって支持されました。
Materials
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
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