לכידת את האינטראקציה קינטיקה החלבון תעלת יונים עם מולקולות קטנות על ידי וזמינותו אינטרפרומטריה ביו-שכבה
Summary
פרוטוקול כאן מתאר את האינטראקציות של מטוהרים hEAG1 יון ערוץ חלבון עם מולקולה קטנה השומנים ליגנד phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (פיפ2). המדידה מדגים כי מתה על יכול להיות שיטה אפשרית להקרנה ליגנד ערוץ הרומן יון מולקולה קטנה.
Abstract
וזמינותו אינטרפרומטריה (בלי) ביו-שכבה הוא כלי רב ערך למדידת חלבון ואינטראקציות מולקולת חלבון-קטן. כאן, נתאר תחילה את היישום של טכניקה זו ללא תווית הרומן ‘ את האינטראקציה של האדם EAG1 (hEAG1) חלבונים ערוץ עם פיפ מולקולה קטנה2. hEAG1 ערוץ הוכר מטרה טיפולית פוטנציאל בגלל שלה ביטוי aberrant סרטן, מוטציות רווח-של-פונקציה מספר מעורבים בסוגים מסוימים של מחלות נוירולוגיות. אנו מטוהר hEAG1 חלבונים ערוץ ממערכת בתרבית של הביטוי יציב, מדדו את האינטראקציה עם פיפ2 מאת רבנות בלי. מדידת מוצלחת קינטיקה של האיגוד בין חלבון hEAG1 ו- PIP2 מדגים כי וזמינותו רבנות בלי היא גישה תפוקה גבוהה פוטנציאליות בשימוש להקרנה ליגנד מולקולה קטנה הרומן בפרמקולוגיה ערוץ יון.
Introduction
פילוח החלבונים ערוץ יון הנגיש על-פני התא עם מולקולות קטנות מציע פוטנציאל עצום ליגנד ההקרנה של תרופות ביולוגיות גילוי1,2,3. לפיכך, מתאימה לכלי יש צורך ללמוד את האינטראקציה בין תעלת יונים, מולקולות קטנות, תפקידם המתאימים. ההקלטה תיקון-קלאמפ הוכח להיות טכניקה ייחודית ובלתי ניתנים להחלפה ביון ערוץ assay פונקציונלי. עם זאת, קביעה אם מולקולות קטנות ישירות למטרה תעלות יונים לדרוש טכנולוגיות אחרות. באופן מסורתי, וזמינותו מחייבת ליגנד רדיואקטיבי שימש כדי לבחון את קינטיקה של האיגוד בין מולקולה קטנה שלה חלבון ערוץ יון היעד. עם זאת, השימוש בטכניקה זו הוא מוגבל בשל דרישה שלה ב תיוג רדיואקטיבי וזיהוי. יתר על כן, השלב מוקדם לה תווית של ליגנד קטן במחקר מונע שלה באמצעות בסוגים רבים של תעלות יונים ללא ידוע ליגנד מסוים. כמה טכניקות ללא תווית כגון NMR ספקטרוסקופיה, קרני רנטגן, microscale thermophoresis (MST)4 , משטח פלזמון תהודה (SPR) שימשו כדי למדוד את האינטראקציות מולקולת חלבון-קטן. אבל אלו סוגים של מבחני בד כ אינו יכול לספק מידע מספיק בגלל הקושי להשיג את החלבון באורך מלא, ברזולוציה נמוכה של dynamics, תפוקה נמוכה, עלות גבוהה5. לעומת שיטות אלה, ביו-שכבה אינטרפרומטריה (רבנות בלי) מתגלה כקבוצה מתודולוגיה הרומן ללא תווית להתגבר על החסרונות האלה לגילוי אינטראקציות חלבון-קטן מולקולה על ידי שיתק של כמויות זעירות של חלבון מדגם של משטחי ביוסנסור ומדידת השינויים אופטי אותות6,7. כפלטפורמה ביוסנסור מבטיח, מתה על הטכניקה מתבצעת כבר כדי לבחון את האינטראקציה של מולקולות קטנות עם מים טבעיים חלבונים מסיסים כגון נוגדן חד שבטי האדם CR80208 , ההליך assay מפורט ודווח ב במאמר הקודם9. למרות התפקיד של יון חלבון ערוץ עבור גילוי מטרות טיפולית חדש זוהה, יש יון ערוץ מולקולת חלבון-קטן אינטראקציה וזמינותו בהתבסס על רבנות בלי לא תוארו.
האדם ערוצי א’ אתר גו-גו (hEAG1) באים לידי ביטוי בסוגים שונים של תאים סרטניים, מערכת העצבים המרכזית, מה שהופך את ערוץ פוטנציאל טיפולי היעד של רבים סרטן, הפרעות עצביים10,11, 12,13,14. המחקר אלקטרופיזיולוגיות במעבדה שלנו אישרה את ההשפעה המעכבת של phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (פיפ2) ערוץ hEAG115. בהתבסס על התוצאות שלנו, בדיקות פיפ2 ישירות אינטראקציה עם hEAG1 על-ידי שימוש בטכניקה רבנות בלי יכול להיות כמודל עבור סוגים אחרים של יון ערוץ מולקולת חלבון-קטן אינטראקציה מורכבת במיוחד עבור ערוצים אלה חסר ליגנדים ספציפיים. בהתאם להנחיות של רבנות בלי assay, אנו מוכנים biotinylated hEAG1 חלבונים, ותשמרו אותם על פני השטח של streptavidin (SA) טיפים ביוסנסור ואחריו אינטראקציה עם אותם לפתרונות2 פיפס להתבונן שלהם קישור ישיר בין חלבון, את השומנים. לאחר מגדילה הקובץ המצורף של פיפ2 משטח מצופה hEAG1 חלבון, עובי השכבה על פני השטח, אשר ישירות מופיע משמרת רפאים, ולא ניתן למדוד בזמן אמת16. קינטיקה האיגוד יכול להיקבע בשל תפנית חיובית בשלב ההתאגדות ואת משמרת שלילית בשלב דיסוציאציה. לפי עיקרון זה, אנחנו מטוהרת החלבון ערוץ יון hEAG1 תפקודית ממערכת ביטוי יציב HEK-239T על-ידי בשיטת טיהור זיקה לשמור במבחנה למצב התפקודי, ואז למדוד את קינטיקה של איגוד של ריכוז שונים פיפ2, הניבו נתונים קינטי semblable כפי שנצפתה מדידות אלקטרופיזיולוגיות15. ההתכתבות קרוב בין תוצאות רבנות בלי מדידות אלקטרופיזיולוגיות להדגים בפעם הראשונה ההתאמה של רבנות בלי ככלי אנליטי המתאים לאינטראקציה יון ערוץ ממברנה מולקולת חלבון-קטן.
Protocol
Representative Results
Discussion
תעלות יונים ממברנה שאומתו כאתרי המטרות הטיפוליות העיקריות של למעלה מ- 13% של תרופות הידועות כרגע לטיפול במגוון מחלות אנושיות, כולל הפרעות נוירולוגיות וכלי דם18. תיקון-קלאמפ הקלטה, תקן הזהב למדידת עם פונקציונליות של תעלות יונים עם מולקולות קטנות, כבר בשימוש נרחב עבור יון ערוץ לי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן מחקרים בין-תחומית SJTU ב רפואה, הנדסה (YG2016QN66), הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (31271217) ו הלאומי בסיסי מחקר תוכנית של סין (2014CB910304) ומרכז ביו-ID.
Materials
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
- Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
- Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
- Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
- Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
- Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
- Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
- Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
- Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
- Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
- Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?. Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).
