Erfassung der Interaktion Kinetics eines Ionenkanals Proteins mit kleinen Molekülen durch die Bio-Schicht Interferometrie Assay

Ausrichtung der Zelle Oberfläche zugänglich Ion Kanalproteinen mit kleinen Molekülen, bietet ein enormes Potenzial für die Liganden Screening und biologische Drug Discovery^1,2,3. Somit ist ein geeignetes Instrument für die Untersuchung der Interaktion zwischen Ionenkanal und kleine Moleküle und ihre entsprechende Funktion erforderlich. Die Patch-Clamp-Aufnahme wurde zu einer einzigartigen und unersetzlichen Technik in Ionen-Kanal funktionelle Assay nachgewiesen. Feststellung, ob die kleinen Moleküle direkt Ionenkanäle Ziel erfordern jedoch andere Technologien. Traditionell wurde radioaktives Ligand-Bindung-Assay verwendet, die Kinetik der Bindung zwischen niedermolekularer und seine Zielprotein Ionen-Kanal zu beobachten. Allerdings beschränkt sich die Nutzung dieser Technik wegen seiner Anforderung in radioaktiven Markierung und Erkennung. Darüber hinaus verhindert, dass der erforderliche Schritt, den kleinen Liganden in der Studie zu kennzeichnen seine Verwendung in vielen Arten von Ionenkanälen ohne bekannte spezifische Liganden. Einige markierungsfreie Techniken wie NMR-Spektroskopie, x-ray Diffraction, Microscale Thermophorese (MST)⁴ und Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) wurden verwendet, um die Protein-kleine Molekül-Interaktionen zu messen. Aber diese Art von Tests in der Regel können nicht wegen der Schwierigkeit, in voller Länge Protein, niedrige Auflösung von Dynamik, niedriger Durchsatz und hohe Kosten⁵zu erhalten ausreichenden Informationen zur Verfügung stellen. Im Gegensatz zu diesen Techniken taucht Bio-Schicht Interferometrie (BLI) als eine neuartige markierungsfreie Methodik zur Überwindung dieser Nachteile zum Nachweis von Protein-kleine Molekül Interaktionen durch eine winzige Mengen des Proteins Probe auf den Oberflächen der Immobilisierung Biosensor und Messung der optischen Veränderung signalisiert^6,7. Als eine vielversprechende Biosensor-Plattform BLI Technik wird bereits durchgeführt, um die Interaktion von kleinen Molekülen mit natürlichem Wasser lösliche Proteine wie ein menschlicher monoklonaler Antikörper CR8020⁸ beobachten und die detaillierte Testverfahren ist berichtet worden, einem vorherige Artikel⁹. Obwohl die Schlüsselrolle der Ionen-Kanal-Protein für neue therapeutische Targets Entdeckung erkannt wurde, wurde die Ionen-Kanal Protein-kleine Molekül Interaktion Assay anhand BLI nicht beschrieben.

Der Mensch Äther À Gogo- Kanäle (hEAG1) werden in verschiedene Arten von Krebszellen und zentrale Nervensystem, wodurch der Kanal A möglichen therapeutischen Angriffspunkt vieler Krebsarten und neuronalen Erkrankungen^{10,11, ausgedrückt 12,13,14}. Die elektrophysiologische Untersuchung in unserem Labor hat die inhibitorische Wirkung von Phosphatidylinositol 4, 5-Bisphosphate (PIP₂) am hEAG1-Kanal¹⁵bestätigt. Anhand unserer Ergebnisse, PIP₂ Tests, direkt als Modell für andere Arten von Ionen-Kanal Protein-kleine Molekül zusammengesetzte Interaktion vor allem für diese Kanäle fehlen spezifische Liganden Interaktion mit den hEAG1 mit BLI Technik sein kann. Entsprechend den Anweisungen des BLI Assays, wir vorbereitet biotinylierte hEAG1 Proteine und immobilisiert ihnen auf der Oberfläche des Streptavidin (SA) Biosensor Tipps gefolgt von Interaktion sie PIP₂ Lösungen zu beobachten, deren direkte Bindung zwischen den Protein und die Lipid. Nach die Befestigung des PIP₂ an die hEAG1 Protein beschichtete Oberfläche, die Dicke der Schicht auf der Oberfläche erhöht, die direkt korreliert die spektrale Verschiebung und können in Echtzeit-¹⁶gemessen werden. Die verbindliche Kinetik kann durch eine positive Wende im Verein Schritt und eine negative Verschiebung der Dissoziation Schritt ermittelt werden. Nach diesem Prinzip wir gereinigt die funktionale hEAG1 Ionen-Kanal-Protein von HEK-239T stabile Expressionssystem mit Affinität Reinigung Methode, die in-vitro- funktionellen Zustand beizubehalten, dann gemessen die Kinetik der Bindung von unterschiedlicher Konzentration₂PIP und ergab eine semblable kinetischen Daten wie Elektrophysiologische Messungen¹⁵beobachtet. Die enge Korrespondenz zwischen den Ergebnissen aus den BLI und Elektrophysiologische Messungen zeigen zum ersten Mal die Eignung von BLI als geeignete analytisches Werkzeug für Ionen-Kanal Membran-Protein-kleine Molekül Interaktion.