التقاط حركية التفاعل البروتين قناة أيون مع جزيئات صغيرة بمقايسة التداخلي بيو-طبقة
Summary
ويصف البروتوكول هنا تفاعلات أيون hEAG1 المنقي قناة البروتين مع جزيء صغير الدهن يجند فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (المرحلة2). القياس يوضح أن BLI يمكن أن تكون طريقة محتملة لرواية جزيء صغير أيون قناة يجند الفرز.
Abstract
فحص قياس التداخل (BLI) بيو-طبقة أداة قيمة لقياس البروتين-بروتين والتفاعلات جزيء البروتين-الصغيرة. هنا، نحن أولاً وصف تطبيق هذا الأسلوب رواية خالية من التسمية دراسة التفاعل بين EAG1 البشري البروتينات قناة (hEAG1) مع برنامج تطبيق السلام جزيء صغير2. قد اعترفت قناة hEAG1 كهدف العلاجية المحتملة بسبب أن overexpression الشاذة في الإصابة بالسرطان وبعض الطفرات مكسب للدالة المشاركة في بعض أنواع من الأمراض العصبية. تنقية البروتينات قناة hEAG1 من نظام تعبير مستقرة الثدييات، وقياس التفاعل مع النقطة2 بواسطة BLI. قياس نجاح الحركية للربط بين البروتين hEAG1 والنقطة2 يوضح أن الإنزيم BLI نهجاً الفائق محتمل استخدامها لفحص الرواية جزيء صغير يجند في الصيدلة قناة أيون.
Introduction
استهداف البروتينات قناة أيون قابلة للوصول من سطح الخلية مع الجزيئات الصغيرة إمكانات هائلة ليجند الفرز والعقاقير البيولوجية اكتشاف1،،من23. وبالتالي، هناك حاجة أداة مناسبة لدراسة التفاعل بين قناة أيون والجزيئات الصغيرة ووظيفتها المقابلة. تم تسجيل التصحيح-المشبك أثبت أن تكون تقنية فريدة من نوعها ولا يمكن الاستغناء عنه في قناة أيون المقايسة الوظيفية. ومع ذلك، تحديد ما إذا كانت الجزيئات الصغيرة المستهدفة مباشرة قنوات أيون تتطلب تكنولوجيات أخرى. تقليديا، استخدمت مقايسة ملزم يجند المشعة لمراقبة حركية الربط بين جزيء صغير والبروتين قناة أيون المستهدفة به. استخدام هذا الأسلوب غير محدودة بسبب متطلباتها في وسم المشعة والكشف. وعلاوة على ذلك، يمنع هذه الخطوة شرط أساسي لتسمية يجند الصغيرة في الدراسة استخدام أنواع عديدة من قنوات أيون دون يجند محددة معروفة. وقد استخدمت بعض التقنيات خالية من تسمية مثل مطيافية الرنين المغناطيسي النووي، حيود الأشعة السينية، وعبارة ثيرموفوريسيس (MST)4 والرنين السطحية مأكل مثل الطحين (موارد البرنامج الخاصة) لقياس التفاعلات جزيء البروتين-الصغيرة. ولكن هذه الأنواع من فحوصات عادة لا توفر معلومات كافية بسبب صعوبة الحصول على كامل طول البروتين، دقة منخفضة من الديناميات، والإنتاجية المنخفضة، وارتفاع تكلفة5. على النقيض من هذه التقنيات، تبرز بيو-طبقة “قياس التداخل” (BLI) كمنهجية خالية من تسمية رواية للتغلب على هذه العوائق للكشف عن التفاعلات جزيء البروتين-الصغيرة بشل حركة كميات صغيرة من البروتين عينة على أسطح بيوسينسور وقياس التغير الضوئية إشارات6،7. كمنصة biosensor واعدة، تتم تقنية BLI الفعل لمراقبة تفاعل الجزيئات الصغيرة مع المياه الطبيعية البروتينات القابلة للذوبان مثل جسم [مونوكلونل] بشرية CR80208 وقد تم الإبلاغ عن إجراء تحليل مفصل في السابقة من المادة9. على الرغم من أن قد تم الاعتراف بالدور الرئيسي للبروتين قناة أيون لاكتشاف الأهداف العلاجية الجديدة، أيون قناة جزيء صغير البروتين التفاعل المقايسة استناداً إلى BLI لا يوصف.
الإنسان يعبر عن قنوات الاثير à الذهاب (hEAG1) في أنواع مختلفة من الخلايا السرطانية والجهاز العصبي المركزي مما يجعل الهدف قناة العلاجية المحتملة العديد من الأمراض السرطانية والاضطرابات العصبية10،11، 13،،من 1214. وأكدت الدراسة الكهربية في المختبر لدينا تأثير المثبطة فوسفاتيديلينوسيتول 4، 5-بيسفوسفاتي (المرحلة2) على قناة hEAG115. استناداً إلى النتائج، واختبار النقطة2 مباشرة يمكن أن يكون التفاعل مع hEAG1 باستخدام تقنية BLI كنموذج لأنواع أخرى من أيون قناة جزيء صغير البروتين التفاعل مركبة خاصة بالنسبة لتلك القنوات التي تفتقر إلى يغاندس المحددة. وفقا لتعليمات الفحص BLI، أعد بيوتينيلاتيد hEAG1 البروتينات ومعطلة لها على سطح ستريبتافيدين (SA) نصائح biosensor متبوعاً بالتفاعل منهم إلى النقطة2 الحلول للاحتفال الربط المباشر بين الدهن والبروتين. بعد إرفاق النقطة2 للسطح المغلفة البروتين hEAG1، وسمك طبقة على السطح يزيد، الذي مباشرة يرتبط التحول الطيفية ويمكن أن يقاس في الوقت الحقيقي16. يمكن تحديد حركية ملزم بسبب تحولاً إيجابيا في خطوة الرابطة وتحولاً سلبيا في خطوة الانفصال. وفقا لهذا المبدأ، نحن تنقية البروتين قناة أيون hEAG1 الوظيفية من نظام مستقر التعبير HEK-239T باستخدام طريقة تنقية تقارب للحفاظ على حالة وظيفية في المختبر ، ثم قياس الحركية ربط تركيز مختلف النقاط2، وتسفر عن بيانات حركية سيمبلابل كما هو ملاحظ في القياسات الكهربية15. المراسلات الوثيق بين النتائج من BLI والقياسات الكهربية تظهر للمرة الأولى مدى ملاءمة BLI كأداة تحليلية مناسبة لايون قناة غشاء صغير البروتين جزيء التفاعل.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم التحقق من غشاء أيون قنوات الأهداف العلاجية الأساسية لما يزيد على 13 في المائة عقاقير المعروفة حاليا لمعالجة مجموعة متنوعة من الأمراض التي تصيب الإنسان، بما في ذلك18من اضطرابات القلب والأوعية الدموية والجهاز العصبي. التصحيح المشبك تسجيل، المعيار الذهبي لقياس الوظيفية لقنو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل مركز بيو-معرف وسيتو صندوق البحوث المتعددة التخصصات في الطب والهندسة (YG2016QN66) ومؤسسة العلوم الطبيعية الصينية الوطنية (31271217)، والوطنية الأساسية البحث البرنامج من الصين (2014CB910304).
Materials
| DMEM/High Glucose Medium | HyClone | SH30243.01 | |
| Phosphate Buffered Saline (1x) | HyClone | SH30256.01 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 1697550 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430599 | 150 mm X 25 mm |
| Nonidet P-40 Substitute | Amresco | E109 | |
| Sodium chloride | BBI Life Sciences | A610476 | |
| Potassium chloride | BBI Life Sciences | A610440 | |
| Bovine Serum Albumin | BBI Life Sciences | A600332 | |
| Polyoxyethylene-20-Sorbitan Monolaurate | BBI Life Sciences | A600560 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| 3x FLAG peptide | Sigma | F4799 | |
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 7.1 | |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | |
| Sulfo-NHS-LC-LC-Biotin | ThermoFisher | 21338 | |
| Centrifugal Machine | ThermoFisher | 75004250 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | ThermoScientific | 318120 | |
| Ultrafiltration device | MILLIPORE | UFC503008 | NMWL of 30 kDa |
| phosphatidylinositol 4, 5-bisphosphate (PIP2) | Sigma | P9763 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody | Sigma | F1804 | 1:2000 dilution |
| goat anti-mouse HRP-conjugated secondary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | 1:5000 dilution |
| Enhanced BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0010 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 04693159001 | |
| Amersham Imager 600 Imaging System | GE Healthcare Bio-Sciences | ||
| Western blot system | BIO-RAD |
References
- Peetla, C., Stine, A., Labhasetwar, V. Biophysical Interactions with Model Lipid Membranes: Applications in Drug Discovery and Drug Delivery. Mol. Pharm. 6 (5), 1264-1276 (2009).
- van de Waterbeemd, H., Smith, D. A., Beaumont, K., Walker, D. K. Property-based design: Optimization of drug absorption and pharmacokinetics. J. Med. Chem. 44 (9), 1313-1333 (2001).
- Papo, N., Shai, Y. Exploring peptide membrane interaction using surface plasmon resonance: Differentiation between pore formation versus membrane disruption by lytic peptides. Biochemistry. 42 (2), 458-466 (2003).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nat. Commun. 1, 100-106 (2010).
- Fechner, P., et al. Size does matter! Label-free detection of small molecule-protein interaction. Anal. Bioanal. Chem. 406 (17), 4033-4051 (2014).
- Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of Bio-Layer Interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. J. Pharm. Biomed. Anal. 72, 150-154 (2013).
- Wartchow, C. A., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25 (7), 669-676 (2011).
- Ekiert, D. C., et al. A Highly Conserved Neutralizing Epitope on Group 2 Influenza A Viruses. Science. 333 (6044), 843-850 (2011).
- Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects. J. Vis. Exp. (84), e51383 (2014).
- Occhiodoro, T., et al. Cloning of a human ether-a-go-go potassium channel expressed in myoblasts at the onset of fusion. Febs Lett. 434 (1-2), 177-182 (1988).
- Pardo, L. A., Stuhmer, W. Eag1: An emerging oncological target. Cancer. Res. 68 (6), 1611-1613 (2008).
- Simons, C., et al. Mutations in the voltage-gated potassium channel gene KCNH1 cause Temple-Baraitser syndrome and epilepsy. Nat. Genet. 47 (1), 73-77 (2015).
- Kortum, F., et al. Mutations in KCNH1 and ATP6V1B2 cause Zimmermann-Laband syndrome. Nat. Genet. 47 (6), 661-667 (2015).
- Han, B., Tokay, T., Zhang, G. M., Sun, P., Hou, S. Eag1 K+ Channel: Endogenous Regulation and Functions in Nervous System. Oxid. Med. Cell. Longev. 2017, (2017).
- Han, B., et al. Human EAG channels are directly modulated by PIP2 as revealed by electrophysiological and optical interference investigations. Sci. Rep. 6, (2016).
- Do, T., et al. A rapid method for determining dynamic binding capacity of resins for the purification of proteins. PREP. 60 (2), 147-150 (2008).
- Rohacs, T., Chen, J., Prestwich, G. D., Logothetis, D. E. Distinct specificities of inwardly rectifying K+ channels for phosphoinositides. J. Biol. Chem. 274 (51), 36065-36072 (1999).
- Overington, J. P., Al-Lazikani, B., Hopkins, A. L. How many drug targets are there?. Nat. Rev. Drug Discov. 5 (12), 993-996 (2006).
- Suh, B. C., Hille, B. PIP2 is a necessary cofactor for ion channel function: How and why?. Annu. Rev. Biophys. 37, 175-195 (2008).
- Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms. J. Vis. Exp. (122), e55659 (2017).
