Integración dirigida CRISPR/Cas9-mediada In Vivo mediante una estrategia basada en unirse a final mediada por homología
Summary
El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) sistema proporciona una herramienta prometedora para la ingeniería genética y abre la posibilidad de integración dirigida de los transgenes. Describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-estrategia por turnos para ADN eficiente objetivo integración en vivo y dirigida terapias genéticas usando CRISPR/Cas9.
Abstract
Como una plataforma de edición de genoma prometedora, el sistema CRISPR/Cas9 tiene gran potencial para la manipulación genética eficiente, especialmente para la integración dirigida de los transgenes. Sin embargo, debido a la baja eficiencia de recombinación homóloga (HR) y las varias mutaciones indel de no homóloga se terminan uniendo (NHEJ)-basado en estrategias en las células no se dividen, en vivo genoma edición sigue siendo un gran desafío. Aquí, describimos una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-sistema CRISPR/Cas9 eficiente en vivo precisa integración específica. En este sistema, el genoma de destino y el donante vector que contiene los brazos de homología (~ 800 bp) flanqueado por destino de RNA (sgRNA) solo guía secuencias son troceadas por CRISPR/Cas9. Esta estrategia basada en HMEJ logra integración eficiente del transgen en cigotos de ratón, así como en hepatocitos en vivo. Por otra parte, una estrategia basada en HMEJ ofrece un enfoque eficaz para la corrección del fumarylacetoacetate hidrolasa (Fah) mutación en los hepatocitos y rescata Fah-deficiencia inducida por ratones de insuficiencia hepática. Tomados en conjunto, centrándose en el objetivo integración, esta estrategia basada en la HMEJ proporciona una herramienta prometedora para una variedad de aplicaciones, incluyendo la generación de modelos animales modificados genéticamente y terapias genéticas específicas.
Introduction
La edición del genoma, precisa, específica es a menudo necesaria para la producción de modelos animales modificados genéticamente y tratamientos clínicos. Se ha realizado mucho esfuerzo para desarrollar diversas estrategias para el genoma objetivo eficiente de edición, como nucleasas de dedos de zinc (ZFN), nucleasas efectoras como activador de transcripción (TALENs) y sistemas de CRISPR/Cas9. Estas estrategias crean roturas de doble cadena DNA específicas (OSD) en el genoma y toman ventaja de intrínsecos sistemas de reparación del ADN, como la recombinación homóloga (HR)1,2, microhomology-mediada se terminan uniendo (MMEJ)3 , 4 , 5y no homólogas terminan uniendo (NHEJ)6,7,8 para inducir la integración dirigida de los transgenes1,9. La estrategia de recursos humanos es actualmente el más de uso general genoma edición de enfoque, que es muy eficiente en las líneas celulares, pero no fácilmente accesibles a las células no se dividen por su ocurrencia restringida en la fase tardía de la S/G2. Así, la estrategia de recursos humanos no es aplicable para en vivo la edición del genoma. Recientemente, la estrategia basada en NHEJ se desarrolló para eficaz de genes knock-en tejidos de ratón8. Sin embargo, el método basado en NHEJ usualmente presenta indels en las uniones, lo que es difícil generar la edición del genoma exacto, especialmente cuando se trata de construir en el marco de la fusión de genes8. Integración dirigida basada en MMEJ es capaz de la edición del genoma exacto. Sin embargo, sólo modestamente aumenta la eficiencia de integración específicas en informes anteriores5. Por lo tanto, mejorar la eficiencia de integración específicas precisa en vivo se necesita urgentemente para amplias aplicaciones terapéuticas3.
En un trabajo publicado recientemente, hemos demostrado una mediada por homología se terminan uniendo (HMEJ)-basado en la estrategia, que mostró la mayor eficiencia de integración específica en todo divulgado estrategias, tanto in vitro e in vivo10. Aquí, describimos un protocolo para el establecimiento del sistema HMEJ, y también la construcción de los vectores de RNA (sgRNA) solo guía al gen de interés y el donante vectores propios sitios de destino sgRNA y ~ 800 bp de brazos de homología (figura 1) . En este protocolo, también se describen los pasos detallados para la generación de ADN knock-en ratones y breves pasos de integración específica en tejidos en vivo. Por otra parte, un estudio de prueba de concepto de la estrategia basada en HMEJ demostrado su capacidad para corregir la mutación de la Fah y rescatar a Fah– / – hígado insuficiencia ratones, que además revelaron su potencial terapéutico.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más críticos en la construcción de plásmidos de donantes HMEJ son: (1) selección de lo sgRNA con alta eficiencia de clivaje de ADN y baja distancia entre sgRNA corte y codón de parada y construcción (2) adecuada de donantes HMEJ. Escote CRISPR/Cas9-mediada en tanto vector de donante transgénico (contiene ~ 800 bp homología brazos y sitios de destino sgRNA) y genoma específica es necesario para la integración específica eficiente y precisa en vivo. Los pasos más críticos de generación de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por CAS estratégicas prioritarias programa de investigación (XDB02050007, XDA01010409), el nacional Hightech R & D programa (programa 863; 2015AA020307), la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (NSFC concede 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), programa de talentos China juvenil de mil (en HY), rotura a través del proyecto de la Academia China de Ciencias, Shanghai ciudad Comité de ciencia y tecnología proyecto (16JC1420202 a HY), el Ministerio de ciencia y tecnología de China (más; 2016YFA0100500).
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
References
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