CRISPR/Cas9 仲介の対象となる統合生体内で相同性を介した終わり参加ベースの戦略を使用して
Summary
クラスター化された定期的に空間短い回文の繰り返し/CRISPR 関連付けられている蛋白質 9 (CRISPR/Cas9) システムは遺伝子工学の有望なツールを提供し、transgenes の対象となる統合の可能性を開きます。(HMEJ) に参加する相同性の終わりについて述べる-ベースの戦略を効率的な DNA が生体内で統合対象し、標的遺伝子療法 CRISPR/Cas9 を使用しています。
Abstract
有望なゲノム編集プラットフォームとして CRISPR/Cas9 システム特に遺伝子の目標とされた統合のための効率的な遺伝的操作のための大きな可能性があります。しかしながら、相同組換え (HR) の効率が低い、非相同末端結合 (NHEJ) 様々 な塩基変異の非分裂細胞、生体内でゲノム編集のままで戦略に大きな課題をに基づいて。(HMEJ) に参加する相同性の終わりを述べる-ベースの正確なターゲットを絞った統合効率的な体内の CRISPR/Cas9 システム。本システムで対象となるゲノムやドナー ベクトル含むホモロジー腕 (~ 800 bp) シーケンスは CRISPR/Cas9 によって裂かれる単一ガイド RNA (sgRNA) ターゲットが並ぶ。この HMEJ ベース作戦マウス受精卵だけでなく、生体内の肝細胞の効率的な遺伝子の統合を実現します。また、HMEJ ベースの戦略の肝細胞における 4-フマリルアセト酢酸加水分解酵素 (ファー) 突然変異の補正のための効率的なアプローチを提供しています、 Fahを救う-欠乏誘発肝障害マウス。一緒に取られて、統合をターゲットに焦点を当てて、この HMEJ ベースの戦略は、有望な世代の遺伝子組み換え動物モデルおよび目標とされた遺伝子治療を含む、アプリケーションのさまざまなツールを提供します。
Introduction
正確なターゲットを絞ったゲノム編集がしばしば遺伝子組み換え動物モデルや臨床治療必要です。効率的な標的ゲノム ジンクフィンガーヌクレアーゼ (ZFN) など、転写活性化因子のようなエフェクター核酸分解酵素 (TALENs) を編集のため様々 な戦略を開発する多くの努力をなされている、CRISPR/Cas9 システム。これらの戦略はゲノムのターゲット DNA 二重鎖切断 (DSB) を作成し、相同組換え (HR)1,2, microhomology を介した終了 (MMEJ)3に参加するなど、本質的な DNA 修復システムを活用,4,5、および非相同末端結合 (NHEJ)6,7,8 transgenes1,9の対象となる統合を誘発します。人事戦略は現在最も一般的に使用されるゲノム編集アプローチは、細胞株で非常に効率的なが、後半の S/G2 段階でその制限の発生による非分裂細胞に容易にアクセスできません。したがって、人事戦略は生体内でゲノム編集のため適用されません。最近、NHEJ ベースの戦略は、マウス組織8での効率的な遺伝子ノックアウトのために開発されました。それにもかかわらず、NHEJ 方式は通常オクターリピート困難に正確なゲノムの編集、特にフレームの融合遺伝子8を構築しようとしたときに生成する交差点を紹介します。MMEJ ベースの対象となる統合は正確な編集が可能です。ただし、のみ控えめ前レポート5の対象となる統合効率が高まります。したがって、生体内で正確なターゲットを絞った統合の効率の向上が急務幅広い治療への応用3。
最近出版された仕事で行った (HMEJ) に参加する相同性の終わり-ベースの戦略は、報告されたすべての戦略を両方生体外でそして生体内の10の最高のターゲットを絞った統合効率を示した。ここでは、HMEJ システムの確立のためのプロトコルについて述べるし、関心とドナーの遺伝子をターゲット シングル ガイド RNA (sgRNA) ベクトルの建設ベクトル遺伝子 sgRNA のターゲット ・ サイトと 〜 800 も相同性腕 (図 1) の bp.このプロトコルでも世代 DNA ノックイン マウスと簡単な手順の生体内の組織の目標の統合のための詳細な手順を説明します。さらに、HMEJ ベースの戦略の概念の実証研究は、 Fah変異を修正し、救助のFah-/-肝障害マウス、さらにその治療の可能性を明らかにする能力を示した。
Protocol
Representative Results
Discussion
HMEJ ドナー プラスミドの構造の最も重要な手順です: (1) 高 DNA の開裂の効率と低 sgRNA 切断サイト停止コドンと (2) 適切な建設 HMEJ ドナーの距離 sgRNA の選択。(SgRNA のターゲット ・ サイトと 〜 800 bp ホモロジー腕含む) 両方の transgene ドナー ベクトル CRISPR/Cas9 を介した胸の谷間、標的ゲノムは効率的かつ正確なターゲットを絞った統合に必要な体内。HMEJ 法を用いたノックアウトのマウ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は CA 戦略的な重点研究プログラム (XDB02050007、XDA01010409)、国民のハイテク R & D プログラム (863 プログラム; 2015AA020307)、中国の国家自然科学基金によって支えられた (NSFC 助成金 31522037、31500825、31571509、31522038)、中国青少年千の才能プログラム (HY) に、ブレーク中国科学アカデミーのプロジェクトは、上海市科学技術委員会プロジェクト (ハイ、16JC1420202) は、科学省と中国の技術 (ほとんど; 2016YFA0100500)。
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
References
- Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Nakade, S., et al. Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9. Nature Communications. 5, 5560 (2014).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Yao, X., et al. Cas9 – Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBioMedicine. , (2017).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yao, X., et al. Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells. Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).
- Han, D. W., et al. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors. Cell Stem Cell. , (2012).
- Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
- Sparman, M., et al. Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates. Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).
- Schatten, G., Mitalipov, S. Developmental biology: Transgenic primate offspring. Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
- Park, K. E., et al. Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins. International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).
- Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Grompe, M., et al. Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice. Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).
- Paulk, N. K., et al. Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo. Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).
