CRISPR/Cas9-vermittelten gezielte Integration In Vivo mit einer Homologie-vermittelte Ende verbinden-basierte Strategie
Summary
Die gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen/CRISPR verbundenen Protein 9 (CRISPR/Cas9) System bietet ein viel versprechendes Instrument für Gentechnik und eröffnet die Möglichkeit, gezielte Integration der transgene. Wir beschreiben eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basierte Strategie für effiziente DNA Integration in Vivo gezielte und gezielte Gentherapien verwenden CRISPR/Cas9.
Abstract
Als eine viel versprechende Genom-editing-Plattform hat das CRISPR/Cas9 System großes Potential für effiziente Genmanipulation, vor allem für die gezielte Integration von transgenen. Aufgrund der geringen Effizienz der homologen Rekombination (HR) und verschiedenen Indel Mutationen von nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ)-basierte Strategien in nicht-teilenden Zellen, in Vivo Genom Bearbeitung bleibt eine große Herausforderung. Hier beschreiben wir eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basiertes CRISPR/Cas9 System zur effizienten in Vivo präzise gezielte Integration. In diesem System, das gezielte Genom und der Spender Vektor mit Homologie Arme (~ 800 bp) flankiert von einzelnen Guide RNA (SgRNA) Ziel Sequenzen sind durch CRISPR/Cas9 gespalten. Diese HMEJ-basierte Strategie erzielt effiziente Transgen Integration in Maus Zygoten sowie in Hepatozyten in Vivo. Darüber hinaus eine HMEJ-basierte Strategie bietet einen effizienten Ansatz zur Korrektur von Fumarylacetoacetate Hydrolase (Fah) Mutation in den Hepatozyten und rettet Fah-Mangel induziert Leberversagen Mäuse. Zusammen genommen, mit Schwerpunkt auf Integration ausgerichtet, diese HMEJ-basierte Strategie bietet ein viel versprechendes Instrument für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Erzeugung von gentechnisch veränderten Tiermodelle und gezielte Gentherapien.
Introduction
Präzise, gezielte Genom-Bearbeitung ist oft für die Herstellung gentechnisch veränderter Tiermodellen und klinischen Therapien erforderlich. Viel Anstrengungen unternommen worden, um verschiedene Strategien für effiziente zielgerichtete Genom bearbeiten, wie z. B. Zink Nuklease (ZFN), Transkription Aktivator-ähnliche Effektor Nukleasen (TALENs) und CRISPR/Cas9 Systeme. Diese Strategien gezielte DNA-Doppel-Strangbrüchen (DSB) im Genom zu erstellen und profitieren Sie von inneren DNA-Reparatursysteme, wie homologe Rekombination (HR)1,2, Microhomology-vermittelte Ende verbinden (MMEJ)3 , 4 , 5und nicht-homologe Ende verbinden (NHEJ)6,7,8 , gezielte Integration der transgene1,9zu induzieren. Die HR-Strategie ist derzeit die am häufigsten verwendeten Genom Bearbeitung Ansatz, der in Zell-Linien sehr effizient, aber nicht teilenden Zellen aufgrund seines beschränkten Auftretens in der Spätphase der S/G2 nicht ohne weiteres zugänglich ist. Der HR-Strategie gilt somit nicht für in Vivo Genom-Bearbeitung. Vor kurzem wurde die Grundstrategie des NHEJ für effiziente gen-Knock-in Maus Gewebe8entwickelt. Dennoch stellt die NHEJ-basierte Methode in der Regel Indels an den Verbindungsstellen, macht es schwierig, präzise Genom-Bearbeitung, vor allem wenn Sie versuchen, im Rahmen Fusion Gene8konstruieren zu generieren. MMEJ-basierte gezielte Integration ist in der Lage, präzise Genom-Bearbeitung. Es erhöht jedoch nur in bescheidenem Maße die gezielte Integration Effizienz in vorherigen Berichten5. Verbesserung der Effizienz der präzise gezielte Integration in Vivo ist daher für breite therapeutische Anwendungen3dringend erforderlich.
In einer kürzlich veröffentlichten Arbeit zeigten wir eine Homologie-vermittelte Ende verbinden (HMEJ)-basierte Strategie, die die höchste Effizienz der gezielte Integration in alle gemeldeten Strategien sowohl in Vitro und in Vivo10zeigte. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Einrichtung des HMEJ Systems, und auch der Bau der Einzel-Guide RNA (SgRNA) Vektoren gezielt das gen des Interesses und des Spenders Vektoren beherbergen SgRNA Ziel-Sites und ~ 800 bp Homologie Wappen (Abbildung 1) . In diesem Protokoll erläutern wir im folgenden die einzelnen Schritte zur Erzeugung von DNA-Knock-in Mäusen und kurze Schritte für die gezielte Integration in Geweben in Vivo. Darüber hinaus zeigte eine Proof-of-Concept-Studie über die HMEJ-basierte Strategie seine Fähigkeit, Fah Mutation zu korrigieren und Fah– / – Leber Versagen Mäuse, die weiter seine therapeutische Potenzial offenbart zu retten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigsten Schritte beim Bau von HMEJ Spender Plasmide sind: (1) Wahl des SgRNA mit hoher DNA Spaltung Effizienz und geringe Abstand zwischen SgRNA schneiden Website und Stopp-Codon und (2) die ordnungsgemäße Errichtung der HMEJ Spender. CRISPR/Cas9-vermittelte Spaltung auf beide Transgen-Spender-Vektor (mit SgRNA-Ziel-Sites und ~ 800 bp Homologie Arme) und gezielte Genom ist notwendig für eine effiziente und präzise gezielte Integration in-vivo. Die wichtigsten Schritte der Generation von Knock-in Mäu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch CAS strategische Priorität Research Program (XDB02050007, XDA01010409), der nationalen Hightech-R & D-Programm (863 Programm; 2015AA020307), der National Natural Science Foundation of China (NSFC Zuschüsse, 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), China Youth tausend Talente Programm (HY), Pause durch Projekt der chinesischen Akademie der Wissenschaften, Projekt Shanghai City Committee von Wissenschaft und Technik (16JC1420202, HY), das Ministerium of Science and Technology of China (die meisten; 2016YFA0100500).
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
References
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