CRISPR/Cas9-gemedieerde gerichte integratie In Vivo met behulp van een homologie-gemedieerde einde deelname aan gebaseerde strategie
Summary
De geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhalingen/CRISPR geassocieerde eiwit 9 (CRISPR/Cas9) systeem biedt een veelbelovend instrument voor de gentechnologie, en opent de mogelijkheid van gerichte integratie van transgenen. We beschrijven een homologie-gemedieerde einde deelname aan (HMEJ)-gebaseerd strategie voor efficiënte DNA integratie in vivo gerichte en gerichte gentherapieën met behulp van CRISPR/Cas9.
Abstract
Als een veelbelovende genoom bewerken platform heeft het CRISPR/Cas9-systeem een groot potentieel voor efficiënte genetische manipulatie, met name voor de gerichte integratie van transgenen. Echter, als gevolg van het lage rendement van homologe recombinatie (HR) en verschillende indel mutaties van niet-homologe einde deelname aan (NHEJ)-op basis van strategieën in niet-delende cellen, in vivo genoom bewerken blijft een grote uitdaging. Hier beschrijven we een homologie-gemedieerde einde deelname aan (HMEJ)-CRISPR/Cas9 systeem voor efficiënte in-vivo nauwkeurig gerichte integratie gebaseerd. In dit systeem, de gerichte genoom en de donor vector met homologie wapens (~ 800 bp) geflankeerd door één gids RNA (sgRNA) doel gekloofd sequenties zijn door CRISPR/Cas9. Deze HMEJ gebaseerde strategie realiseert efficiënte transgenic integratie in muis zygoten, evenals in hepatocyten in vivo. Bovendien, een HMEJ gebaseerde strategie biedt een efficiënte aanpak voor correctie van fumarylacetoacetate hydrolase (Fah) Mutatie in de hepatocyten en redt Fah-deficiëntie geïnduceerde lever mislukking muizen. Samen genomen, gericht op integratie gericht, deze HMEJ gebaseerde strategie biedt een veelbelovende instrument voor een verscheidenheid van toepassingen, waaronder generatie transgene diermodellen en gerichte gentherapieën.
Introduction
Nauwkeurige, gerichte genoom bewerken wordt vaak vereist voor de productie van genetisch gemodificeerde diermodellen en klinisch therapieën. Veel inspanning heeft geleverd om verschillende strategieën voor efficiënte gerichte genoom bewerken, zoals zink vinger nuclease (ZFN), transcriptie activator-achtige effector nucleasen (TALENs), en CRISPR/Cas9 systemen. Deze strategieën gerichte DNA dubbele-strand einden (DSB) maken in het genoom, en te profiteren van de intrinsieke DNA repair systemen, zoals homologe recombinatie (HR)1,2, microhomology-gemedieerde einde deelname aan (MMEJ)3 , 4 , 5en niet-homologe einde deelname aan (NHEJ)6,7,8 te induceren gerichte integratie van transgenen1,9. De HR gebaseerde strategie is momenteel de meest gebruikte genoom bewerken benadering, die zeer efficiënt in cellijnen, maar niet gemakkelijk toegankelijk zijn voor niet-delende cellen als gevolg van deze beperkte zich voordoet in de late S/G2-fase is. De HR gebaseerde strategie geldt dus niet voor in vivo genoom bewerken. Onlangs, is de NHEJ gebaseerde strategie ontwikkeld voor efficiënte gene knock in muis weefsels8. Niettemin, introduceert de NHEJ gebaseerde methode meestal microdeleties op de kruispunten, waardoor het moeilijk voor het genereren van precieze genoom bewerken, vooral wanneer het proberen om te bouwen in-frame fusion genen8. MMEJ-gebaseerde gerichte integratie is geschikt voor het bewerken van de precieze genoom. Echter verhoogt het slechts bescheiden de efficiëntie van de gerichte integratie in vorige verslagen5. Verbetering van de efficiëntie van precies gerichte integratie in vivo is daarom dringend nodig voor brede therapeutische toepassingen3.
In een onlangs gepubliceerde werk, we toonden een homologie-gemedieerde einde deelname aan (HMEJ)-op basis van de strategie, waaruit bleek de hoogste efficiëntie gerichte integratie in alle gerapporteerde strategieën beide in vitro en in vivo10. Hier beschrijven we een protocol voor de oprichting van het HMEJ-systeem, en ook de bouw van de vectoren van single-gids RNA (sgRNA) gericht op het gen van belang en de donor vectoren sgRNA target-sites herbergen en ~ 800 bp homologie wapens (Figuur 1) . In dit protocol beschrijven we ook de gedetailleerde stappen voor generatie van DNA knock-in muizen en korte stappen voor gerichte integratie in weefsels in vivo. Bovendien, een studie van de proof-of-concept van de HMEJ gebaseerde strategie aangetoond haar vermogen te corrigeren Fah mutatie en Fah– / – lever mislukking muizen, die verder geopenbaard zijn therapeutisch potentieel te redden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meest kritische stappen in de bouw van HMEJ donor plasmiden zijn: (1) de selectie van de sgRNA met hoge DNA decollete procesefficiëntie en de lage afstand tussen sgRNA snijden site en stop codon, en (2) goede bouw van HMEJ donor. CRISPR/Cas9-gemedieerde decollete op beide transgenic donor vector (met sgRNA target sites en ~ 800 bp homologie wapens) en gerichte genoom is noodzakelijk voor een efficiënte en nauwkeurige gerichte integratie in vivo. De belangrijkste stappen van de generatie van knock-in muizen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door CAS strategische prioriteit Research Program (XDB02050007, XDA01010409), de nationale Hightech R & D-programma (863 programma; 2015AA020307), de nationale Natural Science Foundation van China (NSFC verleent 31522037, 31500825, 31571509, 31522038), China jeugd duizend talenten programma (HY), Break via project van Chinese Academie van Wetenschappen, project Shanghai City Comité van wetenschap en technologie (16JC1420202 aan HY), het ministerie van wetenschap en technologie van China (de meeste; 2016YFA0100500).
Materials
| pX330 | Addgene | 42230 | |
| pAAV vector | Addgene | 37083 | |
| pX260 | Addgene | 42229 | |
| AAV_Efs_hSpCas9_NLS_FLAG-SV40 | Addgene | 97307 | AAV vector for encoding a human codon-optimized SpCas9 driven by EFs promoter |
| AAV_Actb HMEJ donor_U6_sgRNA_EF1a_GFP_polyA | Addgene | 97308 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Actb. EGFP driven by EF1a promoter and U6-driven sgRNAs targeting Actb. AAV backbone. |
| AAV_Cdx2 HMEJ donor | Addgene | 97319 | HMEJ donor for fusing a p2A-mCherry reporter to mouse Cdx2. |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | Life Technology | L3000015 | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9930 | |
| Bbs I | New England Biolabs | R0539S | |
| NEB Buffer 2 | New England Biolabs | B7002S | |
| T7 endonuclease I | New England Biolabs | M0302L | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621L | |
| Plasmid EndoFree-Midi Kit | Qiagen | 12143 | |
| MMESSAGE MMACHINE T7 ULTRA | Life Technologies | AM1345 | |
| MEGACLEAR KIT 20 RXNS | Life Technologies | AM1908 | |
| MEGASHORTSCRIPT T7 KIT 25 RXNS | Life Technologies | AM1354 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-97 | Micropipette Puller (parameters: heat, 74; pull, 60; velocity, 80; time/delay, 200; pressure, 300) |
| Borosilicate glass | Sutter Instrument | B100-78-10 | type of capillaries (outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.78 mm with filament) |
| FemtoJet microinjector | Eppendorf | ||
| Freezing microtome | Leica | CM1950-Cryostat | thickness of 40 μm for brain, 10 μm for liver |
| Rabbit anti-mCherry | GeneTex | ||
| Cy3-AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | ||
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| FBS | Gibco | 10099141 | |
| NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Pen,Strep,Glutamine | Gibco | 10378016 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500-02 | |
| FACS | BD AriaII | ||
| PMSG | Ningbo Sansheng Medicine | S141004 | |
| HCG | Ningbo Sansheng Medicine | B141002 | |
| Cytochalasin B | Sigma | CAT#C6762 | |
| KSOM+AA with D-Glucose and Phenol Red | Millipore | CAT#MR-106-D | |
| M2 Medium with Phenol Red | Millipore | CAT#MR-015-D | |
| Mineral oil | Sigma |
References
- Yang, H., et al. Generation of Mice Carrying Reporter and Conditional Alleles by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nature Biotechnology. 29 (8), 731-734 (2011).
- Nakade, S., et al. Microhomology-mediated end-joining-dependent integration of donor DNA in cells and animals using TALENs and CRISPR/Cas9. Nature Communications. 5, 5560 (2014).
- Hisano, Y., et al. Precise in-frame integration of exogenous DNA mediated by CRISPR/Cas9 system in zebrafish. Scientific reports. 5, 8841 (2015).
- Yao, X., et al. Cas9 – Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms. EBioMedicine. , (2017).
- Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P., Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homology-independent DNA repair. Genome research. 24 (1), 142-153 (2014).
- Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N., Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Research. 23 (3), 539-546 (2013).
- Suzuki, K., et al. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration. Nature. 540 (7631), 144-149 (2016).
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Yao, X., et al. Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9. Cell Research. 27 (6), 801-814 (2017).
- Han, D. W., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into epiblast stem cells. Nature Cell Biology. 13 (1), 66-71 (2011).
- Han, D. W., et al. Direct Reprogramming of Fibroblasts into Neural Stem Cells by Defined Factors. Cell Stem Cell. , (2012).
- Ambasudhan, R., et al. Direct reprogramming of adult human fibroblasts to functional neurons under defined conditions. Cell Stem Cell. 9 (2), 113-118 (2011).
- Sparman, M., et al. Epigenetic reprogramming by somatic cell nuclear transfer in primates. Stem Cells. 27 (6), 1255-1264 (2009).
- Schatten, G., Mitalipov, S. Developmental biology: Transgenic primate offspring. Nature. 459 (7246), 515-516 (2009).
- Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
- Cong, L., et al. Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Quadros, R. M., et al. Easi-CRISPR: a robust method for one-step generation of mice carrying conditional and insertion alleles using long ssDNA donors and CRISPR ribonucleoproteins. Genome Biology. 18 (1), 92 (2017).
- Park, K. E., et al. Targeted Gene Knockin in Porcine Somatic Cells Using CRISPR/Cas Ribonucleoproteins. International journal of molecular sciences. 217 (6), (2016).
- Woo, J. W., et al. DNA-free genome editing in plants with preassembled CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Nature biotechnology. 33 (11), 1162-1164 (2015).
- Harms, D. W., et al. Mouse Genome Editing Using the CRISPR/Cas System. Current protocols in human genetics. 83, 11-27 (2014).
- Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering. Nature protocols. 9 (8), 1956-1968 (2014).
- Grompe, M., et al. Loss of Fumarylacetoacetate Hydrolase Is Responsible for the Neonatal Hepatic-Dysfunction Phenotype of Lethal Albino Mice. Genes & development. 7 (12), 2298-2307 (1993).
- Paulk, N. K., et al. Adeno-associated virus gene repair corrects a mouse model of hereditary tyrosinemia in vivo. Hepatology. 51 (4), 1200-1208 (2010).
