Mapeamento metabólico: Citoquímica quantitativa enzimática e histoquímica para determinar a atividade de desidrogenases em células e tecidos

Este protocolo segue as diretrizes sobre o uso do material humano do Conselho de revisão médica-ético do centro médico acadêmico. 1. preparação de células ou cortes de tecido Células Trypsinize células de pratos de cultura usando 1 mL de 0,25% do trypsin-EDTA por 5 min a 37 ° C em uma placa de Petri de 10 mm e trazer as células em suspensão de 50.000-200.000 cels/mL, dependendo do tamanho das células de 37 ° C. Anexe a 200 µ l de suspensão de células em lâminas de microscopia usando cytospin funis em um cytocentrifuge a 20 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Secar ao ar livre o cytospins por 24 horas à temperatura ambiente. Isso não afeta a atividade de desidrogenase. 5 Cortes de tecido Extraia o tecido de pacientes ou animais de acordo com autorizações de éticas. 10 mm3 de tecido é suficiente para várias experiências. Colocar as peças de tecido em frascos de plástico pequena 2ml exalada e snap-congelar os frascos contendo o pedaço de tecido em nitrogênio líquido. Armazene os frascos contendo pedaços de tecido −80 ° C até o processamento adicional. Use um meio gelatinosa denominado temperatura de corte ideal (OCT) para montar a amostra de tecido em um mandril que congela até-20 ° C a-25 ° C, rapidamente, para que a água não pode formar cristais. Use um criostato para corte e primeira guarnição do bloco para o nível desejado (idealmente de metade da largura de uma microscopia de vidro slide, por exemplo, 5 x 5 mm). Após o corte, use pincéis e uma placa anti-roll para impedir que as seções de ondulação para cima. Cortar amostras de tecido em seções de 6-10 µm de espessura em uma velocidade lenta mas constante (1 s por seção). Quando uma seção corretamente é cortada, permanece plana na faca micrótomo sob a placa anti-roll. Pegue 1-3 seções sobre lâminas de vidro microscópica e armazenar −80 ° C até o uso. O número de seções preparadas depende do tamanho da amostra de tecido e a espessura desejada das seções. 2. a enzima Histo/Citoquímica para desidrogenases solúveis Preparar o amortecedor da reação. Preparar 100 mL de tampão fosfato do pH correto (ver tabela 1; cada enzima tem um pH ideal em que sua atividade é a mais alta). Por exemplo, misture soluções de 0,1 M KH2PO4 (ácido) e 0,1 M NA2HPO4 (básico) até que seja feita uma reserva com o pH correto. 18 g de álcool polivinílico (PVA) pese o tampão fosfato sob uma coifa como PVA é empoeirada e tóxicos. Dissolver a 18% w/v PVA no tampão fosfato a 100 ° C pelo aquecimento do buffer au bain marie (Coloque a garrafa de vidro em água fervente) e mexendo até o PVA é completamente dissolvido. A solução será então, transparente com pequenas bolhas causadas pela agitação. Normalmente requer ~ 15 min para o PVA dissolver.Nota: A 18% w/v PVA em tampão fosfato é viscoso e podem ser transferido aos tubos de tampão de reação 15ml usando uma pipeta de largura. Armazenamento de curto prazo de 18% p/v PVA em tampão fosfato deve ocorrer no armazenamento a longo prazo (até 2 semanas) e ≥ 40 ° C em ≥ 60 ° C. 250 µ l de 18% p/v PVA em tampão fosfato é normalmente necessário para uma preparação de cytospin, enquanto 500 µ l é necessário para uma secção de tecido. Prepare a solução de sal (nitroBT) de tetrazólio. Para cada 1 mL de meio de incubação, 40 µ l de solução de nitroBT é necessário, que consiste de 5 mg de nitroBT (um pó amarelo) dissolvido em uma mistura de 20 µ l dimetilformamida (DMF) e 20 µ l de etanol, que será uma solução transparente amarela clara.Nota: Porque a estabilidade do nitroBT é menor do que todos os reagentes necessários, é aconselhável preparar a solução de estoque nitroBT última e dissolver o nitroBT no meio de reação primeiro. Dissolver nitroBT em DMF e etanol aquecendo-o em um frasco de vidro durante um curto período de tempo (~ 10 s) usando um bico de Bunsen. Agitar o frasco durante o aquecimento e não deixe o frasco muito tempo na chama para evitar a evaporação. Faça 10% solução nitroBT extra para permitir a evaporação da DMF e etanol durante o processo de dissolução. Escudo do elétron transportadoras Fenazina methosulfate (PMS) ou (1-metoxi)-mídia de methosulfate (mPMS) e incubação de Fenazina contendo m(PMS) de luz direta envolvendo papel alumínio ao redor do frasco de armazenamento de vidro. Preparar soluções reagentes de acordo com a tabela 1 , dissolvendo-os em água destilada H2O. Alguns reagentes perecer rapidamente, então, prepará-los tão pouco antes a experiência possível. Manter soluções reagente no gelo ou a 4 ° C até o uso. Preparar a mídia de incubação, conforme mostrado na tabela 1 e homogeneizar a solução depois de cada passo por agitação suave. Evite a geração de bolhas de ar no meio de incubação agitando continuamente e mantendo a espátula abaixo da superfície do meio de incubação, agitando. Aplicação de meio de incubação para cortes de tecido Microscopia de pre-quente desliza com cytospins ou cortes histologicos anexados a 37 ° C em uma câmara de incubação de imuno-histoquímica de 15 min. Mergulhe a parte inferior da câmara de incubação de imuno-histoquímica com água morna para manter uma temperatura constante na incubadora. Cuidadosamente, quebre ou serrar pipetas Pasteur na transição do estreito para a parte mais larga. Pipetas de Pasteur regulares são demasiado estreitas para aspirar o meio de incubação viscoso, assim que este passo é necessário tornar Pasteur pipetas larga o suficiente para a aspiração do meio de incubação. Aplica 250-500 µ l do meio de incubação adequado a cada preparação da pilha ou a seção de tecido em lâminas de microscopia usando a parte mais larga de uma pipeta Pasteur. Use a ponta da pipeta para distribuída homogeneamente com o meio de incubação. Desconsidere as bolhas de ar pequeno no meio de incubação, porque estas flutuam à superfície e não irão interferir com a reação enzimática na seção preparação ou tecido celular do slide de microscopia. Incubar as preparações da pilha ou seções de tecido sobre as lâminas de microscopia em uma incubadora de 37 ° C (por exemplo, uma incubadora de cultura de tecido) para uma duração predeterminada, dependendo da cinética enzimática e sua expressão em preparação uma célula específica ou tecido (tabela 1). Manter a tampa da câmara de incubação de imuno-histoquímica fechada para manter um ambiente húmido para evitar que o amortecedor da reação da secagem. Lavar as lâminas de microscopia Toque fora meio de incubação em excesso em um lenço. Mecanicamente, enxague no meio de incubação, pelas lâminas de microscopia em 60 ° C tampão fosfato, pH 5,3, movendo as lâminas de microscopia, subindo e descendo no buffer. Isso interrompe a reação enzimática. Lave as lâminas de microscopia, mantendo-os em 60 ° C tampão fosfato, pH 5,3 por 20 min. Mecanicamente, lave as lâminas de microscopia na água da torneira de 60 ° C. Lave as lâminas de microscopia, mantendo-os em água de torneira de 60 ° C por 20 min. Deixe a água e slides arrefecer lentamente misturando temperatura água da torneira com água da torneira de 60 ° C ao longo de 1 minuto. Execute uma etapa de lavagem mecânica final na água da temperatura de água destilada. Coloque o Cytospins manchado ou cortes de tecido em lâminas de microscopia Pré-aquecer um slide mais quente em 50-60 ° C. Cuidadosamente, secar o lado posterior das lâminas de microscopia usando uma toalha de papel e colocá-los no slide mais quente para secar o lado superior do slide microscopia. Quando os slides estiverem secos, coloque preparações da pilha ou cortes de tecido em lâminas de microscopia utilizando as lamelas e o meio de montagem de geleia de glicerol. Salvar as preparações da pilha ou lâminas de microscopia de secções de tecido no escuro em um refrigerador a 4 ° C ou proceder imediatamente com a aquisição de imagens. 3. aquisição de imagem Ganho de gravar imagens com uma câmera de CCD monocromática científica com faixa dinâmica suficiente (pelo menos 8 bits, mas de preferência 10- ou 12 bits), fixadas e uma resposta linear. Selecione um objetivo adequado (20 X de X-63 para cytospins) e 10-63 X para cortes de tecido. Reduza o brilho estreitando o diafragma de campo para que seja um pouco maior que o campo de visão. Uso de luz monocromática, aplicando um filtro de inferência de ampla bandpass nm 10 perto do comprimento de onda isobestic do formazan precipitado7 em combinação com um bloqueio de infravermelho filtro (ver Tabela de materiais).Nota: A absorvância máxima isobestic de nitroBT é em 585 nm. Otimizar a iluminação para garantir que toda a cinza nível gama da câmera é usada (ou seja, definir o nível de iluminação para que a iluminação máxima é alcançada sem excesso de exposição durante a gravação de uma lâmina de microscópio em branco). Calibre os valores medidos níveis de cinza de absorvância conhecida (ou densidade óptica [OD]). Para este fim, captura imagens de escala de cinza pelo menos 10 etapas diferentes de um slide de calibração ou passo tablet com valores conhecidos de OD (consulte a etapa 4.1.1), ambos comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) ou medir um tablet de passo Cunha escala de cinzentos feitos sob medida por um densitophotometer e utilização dos resultados para calibrar medidos cinzenta valores para os valores de absorvância conhecido. Captura de fotomicrografias de células ou cortes de tecido de interesse. 4. análise de imagens Antes da análise de imagem, calibre o software ImageJ para medições de absorvância. Medir a absorvância (OD) de fotomicrografias de pelo menos 10 áreas de calibração com parâmetros conhecidos absorvância no tablet de slide ou etapa de calibração com valores conhecidos de OD. No ImageJ, use Analyze → medida menu ou tecla de atalho Ctrl + M para medir uma área selecionada. Iniciar o procedimento de calibração de absorvância por vai analisar → calibração. Escolha a função “Rodbard (NIH Image)”. Na coluna da esquerda da janela que se abre, os resultados de medições de nível cinzas de cada passo do tablet slide/passo da calibração realizada em 4.1.1 já estão presentes. Se não, copiá-los a partir da tela de resultados do ImageJ. Na coluna à direita, insira cada correspondente valor de absorvância conhecido como impresso sobre o certificado que você recebeu com o tablet passo calibrado. Marque as caixas “calibração Global” e “Trama do Show” e pressione “Okey”. Para controle de qualidade, certificar-se de que o R2 da função Rodbard é > 0,99. Se for < 0,99, verifique se os slides de calibração foram fotografados e medidos corretamente e se os parâmetros de absorvância conhecidos foram inseridos corretamente. ImageJ agora é calibrado até você fechar o programa (daí “Calibração Global”). Para as medidas de absorbância, uma sessão de ImageJ calibrada sempre converte que a absorbância observada significa para valores entre 0 e 1, onde 0 e 1 são as assíntotas de zero e completo absorvância, respectivamente. Para cytospins, selecione > 100 células únicas de forma aleatória. Para cortes de tecido, selecione um ou mais campos de interesse de um comprimento fixo e largura em todas as seções. Projeto uma varredura sobre as fotomicrografias para auxiliar em seleções de célula imparcial. No ImageJ, projetar uma grade sobre uma imagem através do menu Plugins → Analyze → grade. No ImageJ, use a ferramenta elíptica para selecionar células únicas e use a ferramenta retângulo para selecionar regiões de tecido. Medir a absorvância e a área das regiões de tecido ou células selecionadas. A densidade óptica e área são chamados de “Quer dizer” e “Área” no ImageJ resultados da planilha, respectivamente.Nota: A absorvância total de uma região de célula ou tecido (se você tiver selecionado várias regiões de tecido com tamanhos diferentes) é igual à soma de todas as absorvâncias pixel separadas. Se uma célula é fotografada por 1000 pixels, então a absorção total é dada pela soma das absorvâncias 1000 e a absorvância média é dada pelo total de absorvância/1000. Esse procedimento também evita erro distributivos. Determinar a absorbância total média de > 30 células ou regiões de tecido da lâmina de controle, que contém uma amostra que foi exposta para controlar meio de incubação na ausência de substrato mas na presença de cofactores. Absorvância este controle é usado para controle para coloração de atividade de enzima inespecífica e artefatos de absorvância induzida pelas lâminas de microscopia usadas, médio, lamínula ou microscópio de montagem. Subtrai a absorvância média do controle de todas as medidas de absorbância total de amostras que foram expostas ao meio de incubação com a mesma concentração de cofator (mas diferentes concentrações de substrato e/ou inibidor). Isto dá a absorvância total corrigida de uma região da célula ou tecido. Estatisticamente, compare as absorvâncias de totais médias corrigidas usando teste T de Student ou teste de ANOVA One-Way, dependendo do seu projeto experimental. Formazan absorbância pode ser convertida em atividade de enzima (substrato µmol convertido por mL / min) usando a lei de Lambert-Beer: c=A/(є×d), onde c é a concentração de formazan no meio de reação, A é a absorvância medida no ImageJ após calibração; Є é o coeficiente de extinção do formazan (16.000 em 585 nm)8 e d é a luz viajando a distância, que é igual à célula média espessura ou a espessura de corte de seção nominal (6-10 µm neste protocolo).Nota: Após a secagem, a espessura de corte de tecido diminui ~ 50% da espessura do corte da seção nominal, mas isso não se reflete no cálculo acima, porque a espessura nominal de corte é biologicamente mais relevantes. A célula média espessura e dimensões da esfera de célula preparados aderiram a lâminas de vidro de microscopia podem ser determinadas usando microscopia confocal ou microscopia de campo amplo, para os quais protocolos podem ser encontrados em outros lugares. 9 , 10