代謝のマッピング: 定量的酵素組織化学および組織化学細胞や組織における脱水素酵素の活性を決定するには

このプロトコル学術医療センターの医療倫理審査委員会のひと由来の材料の使用に関するガイドラインに従います。 1. 細胞またはティッシュ セクションの準備 セル 10 mm のペトリ皿に 37 ° C で 5 分間 0.25% トリプシン-EDTA の 1 mL を使用して培養皿からセルを trypsinize、50,000 200,000 セル/ml セルのサイズによって懸濁液は 37 ° C のセルをもたらします。 室温で 5 分間で 20 x g で収集 cytospin 目標到達プロセスを使用して顕微鏡スライド上に細胞懸濁液 200 μ L を接続します。 室温で 24 時間 cytospins を空気乾燥します。これは、脱水素酵素活性には影響しません。5 ティッシュ セクション 患者または倫理的な許可によると動物から組織を抽出します。組織の 10 mm3は複数の実験のために十分です。 小さな通気孔のある 2 mL プラスチック容器にティッシュの部分を入れ、スナップ-凍結液体窒素にティッシュの切れ端を含むバイアル。 さらに処理まで −80 ° C で組織部分を含むバイアルを保存します。 水は、結晶を形成できませんので、急速に、-20 ° C ~-25 ° C までフリーズするチャックに組織サンプルをマウントするのに最適な切削温度 (10 月) と呼ばれるゲル状の培地を使用します。 切削と最初トリミング希望のレベルまでブロックのクライオスタットを使用 (理想的には、顕微鏡の幅の半分ガラス スライド、例えば5 mm × 5 mm)。 断面、時にセクションが上向きにカールすることを防ぐためにブラシおよびアンチロール プレートを使用します。 遅いが、一定速度で 6-10 μ m 厚のセクションに組織サンプルをカット (1 セクション毎秒)。セクションは正しくカット、アンチロール プレートの下には、ミクロトーム ナイフに残ります。 顕微鏡によるガラス スライド上の 1-3 セクションをピックアップし、使用するまで −80 ° C で保存します。準備のセクションの数は、組織サンプルのサイズと各セクションの所望の厚さに依存します。 2. 酵素病理組織/溶脱水素酵素の組織化学 反応バッファーを準備します。 正しい pH のリン酸バッファーの 100 mL を準備 (表 1を参照してくださいすべての酵素はその活動は最高で最適な pH)。たとえば、正しい pH のバッファーが行われるまで 0.1 M KH2PO4 (酸性) と 0.1 M NA2HPO4 (基礎) のソリューションをミックスします。 PVA はほこりや有毒なヒューム フードの下でリン酸バッファーにポリビニル アルコール (PVA) の 18 グラムの重量を量る。 バッファーを温暖化によって 18 %w/v PVA 100 ° C でりん酸緩衝を溶かすau のベインさんマリー (水を沸騰のガラス瓶を置く) と PVA を完全に溶解するまで攪拌します。ソリューションは、攪拌によって引き起こされる小さい空気泡と透明になります。通常、溶解する PVA 〜 15 分が必要です。注: 18 %w/v PVA リン酸バッファーには粘性と広いピペットを使用して 15 mL 反応バッファー管に転送することができます。リン酸バッファーの w/v 18 %pva の短期記憶は ≥ に ≥40 ° C および長期保管 (2 週間) で発生する 60 ° Cリン酸バッファーの w/v 18 %pva の 250 μ L は、500 μ L はティッシュ セクションに必要な通常 cytospin の準備のため必要です。 テトラゾリウム塩 (nitroBT) の溶液を準備します。1 mL の培養液のすべて、nitroBT 溶液 40 μ L が必要、20 μ L ジメチルホルムアミド (DMF) のミックスで溶解した nitroBT (黄色い粉) の 5 mg から成ると 20 μ L のエタノールは、黄色い透明な溶液になります。注: nitroBT の安定性が必要な試薬はすべての最も低い、ためにお勧め最後 nitroBT 原液を用意し、まず、nitroBT を反応媒体に溶解します。 DMF やエタノールに nitroBT を時間の短い期間の間にガラスの瓶のそれを熱することによって溶解 (~ 10 s) ブンゼン バーナーを使用しています。加熱中にバイアルを振るし、蒸発を防ぐために炎で長すぎるバイアルを放置しないでください。 10% にする溶解プロセス中に DMF とエタノールの蒸発のために余分な nitroBT ソリューション。 電子キャリア フェナジン methosulfate (PMS) または (1-メトキシ) の盾-フェナチン methosulfate (Mpm) とインキュベーション メディア バイアル ストレージ周りのアルミ箔をラップすることによって直接光から m(PMS) を含みます。 蒸留 H2o. でそれらを溶解して表 1によると、試薬を準備します。いくつかの試薬は急速に滅びる、だからできるだけ実験直前にそれらを準備します。使用するまで氷の上または 4 ° C で、試薬を維持します。 表 1に示すように、培養メディアを準備し、各手順の後穏やかな攪拌によるソリューションを均質化します。培養液中の気泡の生成を避けるため、継続的に攪拌、攪拌しながら培養液の表面の下のへらを保つことによって。 培養液をティッシュ セクションに適用します。 Cytospins 付き中古暖かい顕微鏡用スライドまたはティッシュ セクション 37 ° c 15 分免疫培養室で接続されている水没で一定の温度を維持するために暖かい水で免疫組織化学培養チャンバーの底、インキュベーター。 慎重に分割または狭いから広い部分への移行にパスツール ピペットを見送った。正規のパスツール ピペットが狭いので、このステップはパスツール ピペット培養液の吸引のための十分な幅に必要な粘性培養液を吸引します。 適切な培養液の 250-500 μ L を各セル準備またはティッシュ セクション パスツール ピペットの広い部分を使って顕微鏡スライド上に適用されます。 培養液を均等に広げるためピペット チップを使用します。これらは表面に浮くし、顕微鏡スライドのセルの準備またはティッシュ セクションで酵素反応と干渉しないので、潜伏中に小さな気泡を無視します。 酵素反応速度論と特定セル準備におけるその表現によって、あらかじめ指定された期間間インキュベート細胞または組織切片の顕微鏡スライド 37 ° C の定温器 (例えば培養インキュベーター) または組織 (表 1)。反応バッファーが乾くを防ぐために湿潤環境を維持するために閉じた免疫培養チャンバのリッドを維持します。 顕微鏡スライドを洗浄 ティッシュで余分な培養液をオフをタップします。 機械的に 60 ° C リン酸バッファー、バッファーの顕微鏡スライドを上下移動することによって pH は 5.3 の顕微鏡スライドから培養液を洗い流します。これは、酵素反応を停止します。 60 ° C リン酸バッファー pH 5.3 20 分のためにそれらを保つことによって顕微鏡スライドを洗います。 60 ° C 水道水で顕微鏡スライドを機械的に洗浄します。 20 分の 60 ° C 水道水でそれらを保つことによって顕微鏡スライドを洗います。 水とスライドがゆっくりと 1 分のコース上 60 ° C 水道水常温水道水を混合することによって冷却します。 常温蒸留水に最終的な機械的洗浄のステップを実行します。 ステンド グラス Cytospins または組織切片を顕微鏡スライド上で囲む 前 50-60 ° C で暖かいスライドを温める 慎重にペーパー タオルを使用して顕微鏡スライドの後ろ側を乾燥、顕微鏡スライドの上面を乾燥して暖かいスライドに配置。 スライドが乾燥しているとき、細胞製剤、グリセリン ゼリー マウント媒体と coverslips を用いた顕微鏡スライドに組織切片を囲みます。 4 ° C で冷蔵庫で暗闇の中で細胞またはティッシュ セクション顕微鏡スライドを保存または画像集録をすぐに続行します。 3. 画像の取得 固定、十分なダイナミック レンジ (少なくとも 8 ビットが、好ましくは 10 ビットまたは 12 ビット)、科学的な白黒 CCD カメラで画像を記録利得と線形応答。 (Cytospins の X-63 X 20) と 10 63 X 切片の適切な目的を選択します。 ビューのフィールドよりも若干大きいので、フィールド ダイヤフラムを狭くすることによって、まぶしさを軽減します。 赤外線ブロックとの組み合わせで塩沈殿物7の isobestic 波長付近 10 nm 広い帯域推定フィルターを適用して単色光フィルター (表を参照) を使用します。注: nitroBT の最大 isobestic の吸光度は、585 nm。 カメラの全体のグレーのレベル範囲が使用されるようにする照明を最適化 (過剰空白顕微鏡スライドを記録するときにさらすことがなく最高の照明を達成するすなわち、照明レベルを設定する)。 測定の灰色レベル知られている吸光度 (または光学密度 [外径]) に値を調整します。このため、校正スライドまたはステップの少なくとも 10 の異なる手順のグレイ スケール画像をキャプチャか市販 (参照材料表) 既知の OD 値 (ステップ 4.1.1 を参照) を搭載したタブレットまたは測定によるカスタムメイドのグレー スケール ウェッジ ステップ タブレット、densitophotometer と使用を調整する結果測定知られている吸光度の値に値を灰色します。 興味のティッシュ セクションまたは細胞の顕微鏡写真をキャプチャします。 4. 画像解析 画像解析の前に吸光測定の ImageJ ソフトウェアを調整します。 既知の OD 値と校正スライドまたはステップ タブレットで知られている吸光度パラメーターを少なくとも 10 の校正領域の顕微鏡写真の吸光度 (OD) を測定します。ImageJ、分析 → 対策メニューまたは Ctrl + M ホットキーを使用して、選択した領域を測定します。 分析に行くことによって吸光度調整手順を開始 → 校正。関数「Rodbard (NIH Image)」を選択します。開いたウィンドウの左の列に校正スライド/ステップ タブレット 4.1.1 以降で実行の各ステップから灰色のレベル測定の結果は既にあります。されていない場合は、ImageJ 結果画面からそれらをコピーします。右側の列で校正ステップ タブレットで受信した証明書に印刷される各対応する既知の吸光度の値を入力します。ボックス「グローバル校正」と「表示印刷」をチェックして、「OK」を押します。 品質管理、Rodbard 関数の R2ことを確認 > 0.99。それは場合 < 0.99、チェック知られている吸光度パラメーターが正しく入力されたかどうか、かどうか調整スライドを撮影され、正しく測定します。 ImageJ のキャリブレーションが完了、プログラムを閉じるまで (それ故に「グローバル校正」).吸光度測定用校正 ImageJ セッションを常に観測された吸光度は 0 0 と 1 の間の値に意味に変換 1 ゼロの漸近線と、吸光度をそれぞれフルします。 Cytospins、選択 > ランダムな方法で 100 シングル セル。ティッシュ セクションのすべてのセクションで固定の長さと幅の興味の 1 つまたは複数のフィールドを選択します。 公平なセルの範囲を支援する顕微鏡写真でラスターのプロジェクトです。ImageJ、プラグイン → 分析 → グリッド] メニューを介して画像にグリッドをプロジェクトします。 ImageJ、楕円ツールを使用して、単一のセルを選択し、組織領域を選択する四角形ツールを使用します。 選択したセルまたは組織領域の面積と吸光度を測定します。光学濃度と周辺地域は、「意味」と呼ばれ、ImageJ の「部」結果スプレッドシート、それぞれ。注: セルまたはティッシュの地域 (異なるサイズを持ついくつかの組織の領域を選択した) 場合の総吸光度吸光度で区切られたピクセルすべての合計と同じです。1000 ピクセル、セルのイメージを作成する場合は、全体の吸光度は 1000 の吸光度の和によって与えられるし、平均吸光度は合計 1000 分の吸光度によって与えられます。この手順では、分配のエラーも回避できます。 平均総吸光度を決定 > 30 セルまたはコントロールがない場合は基板が補因子の存在下で培養液にさらされたサンプルが含まれていますコントロール スライドから組織領域。このコントロールの吸光度は、非特異的酵素活性染色の制御に使用され、使用される顕微鏡スライド、媒体、カバー スリップまたは顕微鏡マウントによる吸光度の工芸品。 すべての合計吸光度測定 (基質・阻害剤の濃度の異なる) が補因子の同じ濃度で培養液にさらされたサンプルから平均コントロール吸光度を減算します。これは細胞や組織の地域の修正総吸光度を提供します。 学生の T テストや実験デザインによって、一方向の分散分析テストを使用して平均の修正された合計カラムベッドを統計的に比較します。 塩吸光度による酵素活性 (分あたり mL あたり µmol 変換基板) に変換できるランバート ビールの法則: c=A/(є×d)、c は反応中間体の塩の濃度、A は ImageJ で校正後の測定した吸光度Є は塩の消散係数 (585 で 16.000 nm)8 d、走行可能距離、平均セル厚または公称断面切断厚 (このプロトコルで 6-10 μ m) に等しいである光。注: 乾燥後、組織切片厚低下公称断面切断厚から 〜 50% が公称断面の切断厚は生物学的に高いので、これは上記の計算に反映されていません。平均セル厚及び球については顕微鏡のスライド ガラスに付着したセルの寸法は、共焦点顕微鏡や広視野顕微鏡のプロトコル見つけることができます他の場所を使用して決定できます。9,10