Mappatura metabolica: Enzima quantitativa citochimica e istochimica per determinare l'attività della deidrogenasi in cellule e tessuti

Questo protocollo segue le linee guida sull’uso di materiale umano del Comitato di revisione di Medical-etico di Academic Medical Center. 1. preparazione di cellule o sezioni di tessuto Cellule Tripsinizzano cellule da piastre di coltura con 1 mL di tripsina-EDTA 0.25% per 5 min a 37 ° C in una capsula di Petri da 10 mm e portare le cellule in una sospensione di 37 ° C di 50.000-200.000 cellule/mL, a seconda delle dimensioni delle cellule. Allegare 200 µ l di sospensione cellulare sui vetrini microscopia utilizzando cytospin imbuti in una citocentrifuga a 20 x g per 5 min a temperatura ambiente. Asciugare all’aria i cytospins per 24 h a temperatura ambiente. Non influisce sulla attività della deidrogenasi. 5 Sezioni di tessuto Estratto di tessuto da pazienti o animali secondo etici permessi. 10 mm3 del tessuto è sufficiente per esperimenti multipli. Mettere i pezzi di tessuto in fiale di plastica piccolo ventilato 2 mL e snap-congelare le fiale contenenti il pezzo di tessuto in azoto liquido. Conservare i flaconcini contenenti pezzi di tessuto a − 80 ° C fino a ulteriore elaborazione. Usare un mezzo di simil-gel denominato temperatura di taglio ottimale (OCT) per montare il campione di tessuto su un mandrino che congela rapidamente, fino a-20 ° C a-25 ° C, in modo che acqua non può formare cristalli. Utilizzare un criostato per taglio e prima tagliare il blocco al livello desiderato (idealmente la metà della larghezza di una microscopia vetro diapositiva, ad esempio 5 x 5 mm). Al momento di sezionamento, utilizzare spazzole e una piastra stendi per impedire le sezioni di arricciatura verso l’alto. Tagliate 6-10 µm di spessore sezioni ad una velocità lenta ma costante di campioni di tessuto (1 s per ogni sezione). Quando una sezione è tagliata correttamente, rimane piatta sul coltello microtomo sotto la piastra stendi-fetta. Prendere 1-3 sezioni su vetrini microscopici e conservare a − 80 ° C fino all’utilizzo. Il numero di sezioni preparate dipende la dimensione del campione di tessuto e lo spessore desiderato della sezione. 2. enzima Histo/citochimica per deidrogenasi solubili Preparare il tampone di reazione. Preparare 100 mL di tampone fosfato del pH corretto (vedere tabella 1; ogni enzima ha un pH ottimale a cui la sua attività è la più alta). Per esempio, mescolare soluzioni di 0.1 M KH2PO4 (acida) e 0,1 M NA2HPO4 (base) fino a quando un buffer con il pH corretto è fatto. Peso 18 g di alcol polivinilico (PVA) nel buffer fosfato sotto cappa aspirante come PVA è polverosa e tossici. Sciogliere il 18% w/v PVA nel tampone fosfato a 100 ° C, riscaldando il tampone au bain marie (mettere la bottiglia di vetro in acqua bollente) e mescolare fino a quando il PVA è completamente sciolto. La soluzione sarà quindi, trasparente con piccole bolle d’aria che sono causate dall’agitazione. Richiede tipicamente ~ 15 min per il PVA sciogliere.Nota: Il 18% w/v PVA in tampone fosfato è viscoso e possono essere trasferito su tubi di buffer di reazione 15 mL utilizzando una pipetta ampia. Deposito a breve termine di 18% w/v PVA in tampone fosfato deve essere eseguita a ≥ 40 ° C e archiviazione a lungo termine (fino a 2 settimane) a ≥ 60 ° C. 250 µ l di 18% w/v PVA in tampone fosfato è in genere necessaria per una preparazione di cytospin, mentre 500 µ l è necessario per una sezione di tessuto. Preparare la soluzione di sale (nitroBT) di tetrazolium. Per ogni 1 mL di medium di incubazione, 40 µ l di soluzione di nitroBT è richiesto, che consiste di 5 mg di nitroBT (una polvere gialla) disciolto in un mix di 20 µ l dimetilformammide (DMF) e 20 µ l di etanolo, che sarà una soluzione trasparente gialla chiaro.Nota: Poiché la stabilità del nitroBT è il più basso di tutti i reagenti necessari, si consiglia di preparare la soluzione di riserva nitroBT Ultima e sciogliere il nitroBT nel mezzo di reazione prima. Sciogliere nitroBT in DMF ed etanolo riscaldando in un flaconcino di vetro durante un breve periodo di tempo (~ 10 s) utilizzando un bruciatore di Bunsen. Agitare il flaconcino durante il riscaldamento e non lasciare la fiala troppo a lungo nella fiamma per evitare l’evaporazione. Fare 10% supplementare nitroBT soluzione per consentire l’evaporazione del DMF ed etanolo durante il processo di dissoluzione. Schermare l’elettrone vettori fenazina methosulfate (PMS) o (1-metossi)-fenazina methosulfate (mPMS) e incubazione media contenenti m(PMS) dalla luce diretta in carta stagnola avvolgendo la fiala in vetro deposito. Preparare soluzioni reagenti secondo la tabella 1 di loro dissoluzione in acqua distillata H2O. Alcuni reagenti perisca rapidamente, così prepararli come poco prima dell’esperimento come possibile. Mantenere soluzioni reagenti in ghiaccio o a 4 ° C fino all’utilizzo. Preparare il supporto di incubazione come mostrato in tabella 1 e omogeneizzare la soluzione dopo ogni passaggio mediante agitazione delicata. Evitare la generazione di bolle d’aria nel medium di incubazione mescolando continuamente e tenendo la spatola sotto la superficie del medium di incubazione continuando a mescolare. L’applicazione di Medium di incubazione a sezioni di tessuto Microscopia di pre-riscaldare le diapositive con cytospins o sezioni di tessuto fissate a 37 ° C in una camera di incubazione di immunohistochemistry per 15 min. Immergere il fondo della camera di incubazione immunohistochemistry con acqua tiepida per mantenere una temperatura costante nella incubatrice. Attentamente rompere o segare pipette Pasteur nel passaggio dalla stretta per la parte larga. Pipette Pasteur regolari sono troppo strette per aspirare il medium di incubazione viscoso, quindi questo passaggio è necessario per rendere Pasteur pipette sufficientemente ampia per l’aspirazione di medium di incubazione. Applicare 250-500 µ l di medium di incubazione appropriato a ogni preparazione delle cellule o la sezione di tessuto su vetrini microscopia utilizzando la parte larga di una pipetta di Pasteur. Utilizzare la punta della pipetta per stendere uniformemente il medium di incubazione. Ignorare piccole bolle d’aria nel medium di incubazione, perché questi verranno a galla e non interferirà con la reazione enzimatica nella sezione preparazione o tessuto delle cellule nella diapositiva di microscopia. Incubare le preparazioni di cellule o sezioni di tessuto sui vetrini microscopia in un incubatore a 37 ° C (ad es. un incubatore di coltura del tessuto) per una durata pre-specificata, a seconda la cinetica enzimatica e la sua espressione in una preparazione particolare cella o tessuto (tabella 1). Tenere il coperchio della camera di incubazione immunohistochemistry chiusa per mantenere un ambiente umido per evitare che il tampone di reazione dall’asciugarsi. Lavare i vetrini microscopia Toccare i medium di incubazione in eccesso su un tessuto. Risciacquare meccanicamente il medium di incubazione dalle diapositive di microscopia in tampone fosfato di 60 ° C, pH 5.3, spostando su e giù le diapositive di microscopia nel buffer. Questo interrompe la reazione enzimatica. Lavare i vetrini microscopia tenendole in tampone fosfato di 60 ° C, pH 5.3 per 20 min. Meccanicamente, lavare i vetrini microscopia a 60 ° C l’acqua del rubinetto. Lavare i vetrini microscopia tenendole in acqua di rubinetto di 60 ° C per 20 min. Lasciare che l’acqua e scivoli raffreddino mescolando lentamente la temperatura acqua di rubinetto con l’acqua del rubinetto di 60 ° C nell’arco di 1 minuto. Eseguire un passaggio finale lavaggio meccanico in acqua a temperatura ambiente acqua distillata. Racchiudere i Cytospins macchiato o sezioni di tessuto su vetrini microscopia Pre-riscaldare una diapositiva più calda a 50-60 ° C. Attentamente a secco il lato posteriore delle diapositive microscopia utilizzando un tovagliolo di carta e metterli sulla diapositiva più caldo ad asciugare il lato superiore della diapositiva microscopia. Quando le diapositive sono asciutte, racchiudere preparazioni di cellule o sezioni di tessuto su vetrini microscopia usando coprioggetti e mezzo di montaggio gelatina glicerolo. Salvare le preparazioni delle cellule o del tessuto sezioni microscopia diapositive al buio in frigorifero a 4 ° C o procedere immediatamente con l’acquisizione di immagini. 3. acquisizione immagini Guadagno di registrare immagini con una telecamera CCD monocromatica scientifica con gamma dinamica sufficiente (almeno 8 bit ma preferibilmente 10 bit o 12 bit), fissate e una risposta lineare. Selezionare un obiettivo adeguato (20 X X-63 per cytospins) e 10-63 X per sezioni di tessuto. Ridurre l’abbagliamento restringendo il diaframma di campo in modo che è leggermente più grande del campo visivo. Uso di luce monocromatica applicando un filtro di inferenza di passa-banda larga nm 10 vicino alla lunghezza d’onda di isobestic di formazano precipitato7 in combinazione con un blocco a infrarossi filtro (Vedi Materiali tavolo).Nota: L’assorbanza massima isobestic di nitroBT è a 585 nm. Ottimizzare illuminazione per garantire che venga utilizzata l’intera gamma di livello grigio della fotocamera (ad esempio, impostare il livello di illuminazione affinché illuminamento massimo è raggiunto senza sovraesporre quando si registra un vetrino da microscopio in bianco). Calibrare i valori misurati livelli di grigio a noto assorbanza (o densità ottica [OD]). A tal fine, catturare immagini di scala di grigi di almeno 10 diversi passi di un vetrino di calibrazione o di passaggio per tablet con valori OD noti (Vedi punto 4.1.1), entrambi disponibili in commercio (Vedi Materiali tavolo) o misurare una tavoletta di passaggio zeppa di scala di grigi su misura da un densitophotometer e utilizzare i risultati per calibrare misurati grigio valori ai valori di assorbanza noto. Catturare le microfotografie di cellule o sezioni di tessuto di interesse. 4. image Analysis Prima dell’analisi di immagine, calibrare il software ImageJ per misure di assorbanza. Misurare l’assorbanza (OD) di microfotografie di almeno 10 aree di calibrazione con i parametri noti assorbanza della compressa di diapositiva o passaggio di calibrazione con valori noti OD. In ImageJ, utilizzare il menu Analizza → misura o tasto di scelta rapida Ctrl + M per misurare un’area selezionata. Avviare la procedura di calibrazione di assorbanza andando a Analyze → calibrazione. Scegliere la funzione “Rodbard (NIH Image)”. Nella colonna sinistra della finestra che si apre, i risultati delle misurazioni di livello grigi da ogni passo della tavoletta diapositiva/passo calibrazione eseguita in 4.1.1 sono già presenti. In caso contrario, copiarli dalla schermata di risultati di ImageJ. Nella colonna di destra, è necessario immettere ciascun valore di assorbanza noto corrispondente come stampato sul certificato ricevuto con la tavoletta di passaggio calibrato. Barrare le caselle “calibrazione globale” e la “Trama Show” e premere “OK”. Per il controllo qualità, assicurarsi che il R2 della funzione Rodbard è > 0,99. Se è < 0,99, verifica se le diapositive di taratura sono state fotografate e misurate correttamente e se i parametri di assorbanza noti sono stati immessi correttamente. ImageJ è ora calibrato finché non si chiude il programma (quindi “Calibrazione globale”). Per le misure di assorbanza, una sessione di ImageJ calibrata sempre converte che l’assorbanza osservato significa per valori compresi tra 0 e 1, dove 0 e 1 sono gli asintoti pari a zero e pieno assorbanza, rispettivamente. Per cytospins, selezionare > 100 singole cellule in modo casuale. Per sezioni di tessuto, selezionare uno o più campi di interesse di una lunghezza fissa e la larghezza in tutte le sezioni. Progetto un raster sopra le microfotografie per facilitare le selezioni di cella imparziali. In ImageJ, proiettare una griglia su un’immagine tramite il menu Plugins → analizza → griglia. In ImageJ, utilizzare lo strumento ellittica per selezionare singole cellule e utilizzare lo strumento rettangolo per selezionare aree di tessuto. Misurare l’assorbanza e l’area di celle selezionate o regioni di tessuto. La densità ottica e la zona sono chiamati “Significa” e “Area” nella ImageJ risultati foglio di calcolo, rispettivamente.Nota: L’assorbanza totale di una regione delle cellule o del tessuto (se è stato selezionato parecchie regioni di tessuto con diverse dimensioni) è uguale alla somma di tutti i pixel separati assorbanze. Se una cella è ripreso da 1000 pixel, quindi l’assorbanza totale è data dalla somma delle assorbanze 1000 e l’assorbanza media è data dal totale assorbanza/1000. Questa procedura evita anche errore distribuzionali. Determinare l’assorbanza media totale di > 30 celle o regioni di tessuto dalle diapositive di controllo, che contiene un esempio che è stato esposto per controllare medium di incubazione in assenza del substrato, ma in presenza di cofattori. Questa assorbanza di controllo utilizzato per controllo di non specifico enzima attività di colorazione e manufatti di assorbanza indotta dalle diapositive utilizzate microscopia, montaggio medio, vetrini coprioggetto o microscopio. Sottrarre l’assorbanza media controllo da tutte le misure di assorbanza totale dei campioni che sono state esposte al mezzo di incubazione con la stessa concentrazione di cofattore (ma diverse concentrazioni di substrato e/o inibitore). Questo dà l’assorbanza totale corretta di una regione delle cellule o del tessuto. Confronta statisticamente gli assorbimenti totali corretti medio utilizzando lo studente T-test o test ANOVA unidirezionale, a seconda della progettazione sperimentale. Formazano assorbanza può essere convertito in enzima attività (substrato convertito µmol / mL / min) tramite la legge di Lambert-Beer: c=A/(є×d), dove c è la concentrazione di formazan nel mezzo di reazione, A è l’assorbanza misurata in ImageJ dopo la calibrazione; Є è il coefficiente di estinzione di formazan (16.000 a 585 nm)8 e d è la luce che viaggia di distanza, che è uguale a spessore medio della cella o spessore di taglio di sezione nominale (6-10 µm in questo protocollo).Nota: Dopo l’essiccazione, dello spessore di sezione del tessuto diminuisce ~ 50% dallo spessore nominale di sezione taglio, ma questo non si riflette nel calcolo sopra perché lo spessore di taglio di sezione nominale è biologicamente più rilevanti. Lo spessore medio delle cellule e la sfera dimensioni della cella preparates aderito a vetrini di microscopia possono essere determinati mediante microscopia confocale o grandangolari microscopia, per i quali protocolli possono essere reperiti altrove. 9 , 10