מיפוי מטבולית: אנזים כמותית Cytochemistry ו להסטולוגיה כדי לקבוע את הפעילות של Dehydrogenases של תאים ורקמות

פרוטוקול זה עוקב אחר ההנחיות על השימוש של החומר האנושי של ועדת הבדיקה אתיות הרפואי של המרכז הרפואי האקדמי. 1. הכנת תאים או רקמות מקטעים תאים Trypsinize תאים מן התרבות מנות באמצעות 1 מ”ל של 0.25% טריפסין-EDTA עבור 5 דקות ב 37 ° C ב- 10 מ מ פטרי ולהביא התאים ב- 37 מעלות צלזיוס השעיה של 50,000-200,000 תאים למ”ל, בהתאם לגודל של התאים. לצרף 200 µL של התליה תא אל שקופיות מיקרוסקופ באמצעות cytospin funnels cytocentrifuge ב 20 x g למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מילה נהדרת של cytospins עבור 24 שעות בטמפרטורת החדר. הגדרה זו אינה משפיעה פעילות דהידרוגנאז. 5 מקטעי רקמת מבקר המסעדות חולים או בעלי חיים על פי היתרים אתית. 10 מ מ3 של רקמות מספיקה עבור ניסויים מרובים. לשים את פיסות רקמה לתוך צלוחיות פלסטיק קטן מ ל 2 פרקו, snap-להקפיא הבקבוקונים המכיל פיסת הרקמה של חנקן נוזלי. אחסן את הבקבוקונים המכילה חתיכות רקמה −80 ° C עד עיבוד נוסף. השתמש מדיום דמוי ג’ל הנקרא טמפרטורה אופטימלית חיתוך (אוקטובר) כדי לטעון את דגימת רקמה על צ’אק שקופא ל-20 ° C ל–25 ° C במהירות, כך מים לא יכול ליצור גבישים. שימוש cryostat חיתוך והראשון לקצץ את הבלוק לרמה הרצויה (אידיאלי חצי מרוחב מיקרוסקופיה זכוכית שקופית, למשל 5 מ מ x 5 מ מ). עם חלוקתה, להשתמש מברשות, צלחת אנטי-לגלגל כדי למנוע את המקטעים מסתלסל כלפי מעלה. לחתוך דגימות רקמה למקטעים מיקרומטר בעובי 6-10 במהירות איטי אך קבוע (1 s לכל סעיף). כאשר מקטע הוא נחתך כראוי, נותר שטוח על הסכין מיקרוטום כתשר אנטי-רול. לאסוף את סעיפים 1-3 בשקופיות זכוכית microscopical ולאחסן ב −80 ° C עד השימוש. מספר קטעים מוכן תלוי בגודל של דגימת הרקמות העובי הרצוי של הסעיפים. 2. אנזים היסטו/Cytochemistry עבור Dehydrogenases מסיסים הכנת מאגר התגובה. להכין 100 מ של פוספט מאגר של ה-pH נכונה (ראו טבלה 1; לכל אנזים יש של pH אופטימלי בו פעילות שלה הוא הגבוה ביותר). לדוגמה, מערבבים פתרונות של 0.1 מ’ ח’2PO4 (חומצי) ו 0.1 M נה2HPO4 (בסיסי) עד מאגר עם ה-pH נכונה. שוקל 18 גרם אלכוהול (PVA) למאגר פוספט ברדס fume כמו PVA מאובק ולא רעילים. התמוססות של 18% w/v PVA במאגר פוספט ב 100 מעלות צלזיוס על ידי ההתחממות המאגר au ביין מארי (לשים בקבוק הזכוכית במים רותחים), תוך ערבוב עד PVA התפרקה לחלוטין. הפתרון יהיה שקוף, עם בועות אוויר קטנות שנגרמות על ידי ערבוב. זה בדרך כלל דורש ~ 15 דקות בשביל PVA להתמוסס.הערה: 18% w/v PVA במאגר פוספט צמיגה, ניתן להעביר 15 מ”ל התגובה מאגר צינורות באמצעות פיפטה רחב. אחסון לטווח קצר של 18% w/v PVA במאגר פוספט צריכה להתרחש ≥40 ° C, לאחסון לטווח ארוך (עד 2 שבועות) אצל ≥ 60 מעלות צלזיוס. µL 250 של 18% w/v PVA במאגר פוספט נדרש בדרך כלל עבור הכנה cytospin, בעוד 500 µL נדרש עבור מקטע רקמות. להכין פתרון מלח (nitroBT) tetrazolium. עבור כל 1 מ”ל של דגירה מדיום, µL 40 של nitroBT פתרון נדרש, בהיקף של 5 מ”ג של nitroBT (אבקה צהובה) מומס שילוב של µL 20 dimethylformamide (DMF) ו- µL 20 של אתנול, אשר יהיה פתרון שקוף צהוב בהיר.הערה: בגלל היציבות של nitroBT הוא הנמוך ביותר של כל ריאגנטים הכרחי, מומלץ להכין את הפתרון מניות nitroBT אחרונה ולקבל להמיס את nitroBT לתוך האמצעי תגובת קודם. להמיס nitroBT DMF, אתנול על ידי חימום זה בקבוקון זכוכית במשך תקופה קצרה של זמן (~ 10 s) באמצעות מבער בונזן. לנער את המבחנה בזמן חימום, אל תשאירו את המבחנה יותר מדי זמן ב הלהבה כדי למנוע התאיידות. להפוך את 10% הפתרון nitroBT נוספת כדי לאפשר אידוי DMF ואתנול במהלך תהליך המסת. מגן על אלקטרון נשאים phenazine methosulfate (PMS) או (1-מתוקסי)-phenazine methosulfate (mPMS), דגירה מדיה המכילה m(PMS) של אור ישיר על-ידי גלישת נייר כסף סביב המבחנה אחסון זכוכית. להכין ריאגנט פתרונות על פי טבלה 1 על ידי המסת אותם מזוקקים H2O. כמה ריאגנטים לגווע במהירות, אז הכינו אותם כמו זמן קצר לפני הניסוי ככל האפשר. לשמור פתרונות מגיב על קרח או ב 4 ° C עד השימוש. להכין מדיה הדגירה כפי שמוצג בטבלה 1 , homogenize את הפתרון לאחר כל שלב על ידי ערבוב עדין. להימנע הדור של בועות אוויר בתוך המדיום הדגירה תוך ערבוב מתמיד ושמירה המרית מתחת לפני השטח של המדיום הדגירה תוך כדי ערבוב. החלת הדגירה בינוני על מקטעים של רקמות שקופיות מיקרוסקופ חם מראש עם cytospins או רקמות מקטעים מצורף ב- 37 מעלות צלזיוס ב חדר הדגירה אימונוהיסטוכימיה במשך 15 דקות להטביע בתחתית תא הדגירה אימונוהיסטוכימיה במים חמים כדי לשמור על טמפרטורת חום קבועה ב- חממה. בזהירות לשבור או לנסר את פיפטות פסטר-המעבר הצר החלק הרחב. פיפטות פסטר רגיל צרים מדי האחות המדיום הדגירה צמיגה, אז שלב זה יש צורך להפוך רחב מספיק עבור השאיפה של המדיום הדגירה פיפטות פסטר. החל 250-500 µL של המדיום הדגירה המתאים לכל תא הכנה או סעיף הרקמה על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות החלק הרחב של פיפטה פסטר. להשתמש את הטיפ פיפטה שמתפזר המדיום הדגירה. להתעלם בועות אוויר קטנות במדיום דגירה, כי אלה יצופו על פני השטח לא יתערב התגובה אנזימטי בסעיף תא הכנה או רקמות בשקופית מיקרוסקופ. תקופת דגירה של ההכנות התא או מקטעי רקמת על השקופיות מיקרוסקופיה 37 ° C חממה (למשל חממה תרביות רקמה) של משך זמן שצוין מראש, בהתאם קינטיקה אנזימטית את ביטויה בהכנה לתא מסוים או רקמה (טבלה 1). שמור את המכסה של תא הדגירה אימונוהיסטוכימיה סגורות כדי לשמור על סביבה לחה כדי למנוע את המאגר תגובה ממנו להתייבש. שטיפת שקופיות מיקרוסקופ הקש את הדגירה עודף בינוני על טישו. מכנית לשטוף המדיום הדגירה מהשקופיות מיקרוסקופ במאגר פוספט 60 ° C, pH 5.3, על ידי העברת שקופיות מיקרוסקופ למעלה ולמטה במאגר. זה עוצר את התגובה אנזימטיות. לשטוף את שקופיות מיקרוסקופ על ידי שמירה על אותם במאגר פוספט 60 ° C, pH 5.3 כעשרים דקות. מכנית לשטוף את שקופיות מיקרוסקופ במי ברז 60 ° C. לשטוף את שקופיות מיקרוסקופ על ידי שמירה על אותם במי ברז 60 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. תן למים, שקופיות להתקרר לאט ערבוב מי ברז בטמפרטורת החדר עם מי הברז 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה. לבצע צעד סופי כביסה מכני במים מזוקקים בטמפרטורת החדר. הקף את Cytospins מוכתם או מקטעי רקמת על שקופיות מיקרוסקופ לחמם שקופית חם יותר ב 50-60 ° c בזהירות לייבש את הצד האחורי של שקופיות מיקרוסקופ בעזרת מגבת נייר ומניחים על השקופית חם לייבוש את הצד העליון של השקופית מיקרוסקופ. כאשר השקופיות יבש, הקף תא ההכנות או מקטעים רקמות על שקופיות מיקרוסקופ באמצעות גליצרול ג’לי הרכבה בינונית ו coverslips. שמור את ההכנות התא או שקופיות מיקרוסקופ מקטעים רקמות בחושך במקרר ב 4 ° C או ומיד להמשיך עם ייבוא תמונות. 3. ייבוא תמונות תגובה לינארית ורווח תמונות רשומה עם מצלמה מדעי CCD בשחור-לבן עם טווח דינמי מספיק (לפחות 8-bit, אבל רצוי 10 סיביות או 12 סיביות), קבוע. בחר מטרה נאותה (20 X X-63 עבור cytospins) ו- 10-63 X עבור מקטעים רקמות. לצמצם בוהק על-ידי צמצום הסרעפת שדה כך שזה מעט גדול יותר מאשר שדה הראיה. שימוש אור מונוכרומטי על-ידי החלת מסנן היסק bandpass רחב nm 10 ליד הגל isobestic של precipitate formazan7 בשילוב עם חסימת אינפרא-אדום לסנן (ראה טבלת חומרים).הערה: ספיגת isobestic מקסימלית של nitroBT הוא-585 ננומטר. מיטוב תאורה על מנת להבטיח כי הטווח כולו רמת האפור של המצלמה משמש (קרי, להגדיר את רמת תאורה כך תאורה המרבית מושגת ללא חשיפת יתר על המידה בעת הקלטת שקופית מיקרוסקופ ריק). כיילו ערכים נמדדו רמות אפור ספיגת הידוע (או צפיפות אופטית [OD]). למטרה זו, לכידת תמונות גוני האפור לפחות 10 שלבים שונים של כיול בשקופית או שלב לוח עם ערכים OD ידוע (ראה שלב 4.1.1), או זמינים מסחרית (ראה טבלת חומרים) או למדוד את לוח שלב טריז סולם אפור בהזמנה אישית על ידי densitophotometer ושימוש למדוד התוצאות כדי לכייל את גריי ערכים לערכים ספיגת ידוע. ללכוד את photomicrographs של תאים או רקמות מקטעים של עניין. 4. תמונות ניתוח לפני ניתוח תמונות, לכייל את התוכנה ImageJ עבור ספיגת מדידות. למדוד את ספיגת (OD) של photomicrographs לפחות 10 אזורים כיול עם ספיגת ידועים פרמטרים בכיול שקופית או שלב הלוח עם ערכים OD ידועים. ב- ImageJ, השתמש נתח ← מידה תפריט או Ctrl + M hotkey כדי למדוד את האזור הנבחר. מתחילה ההליך כיול ספיגת על נתח ← כיול. בחר פונקציה “Rodbard (NIH תמונה)”. בעמודה השמאלית של החלון שנפתח, תוצאות מדידות רמת האפור של כל שלב של הלוח שקופיות/שלב כיול הופיעה 4.1.1 כבר קיימים. אם לא, העתק אותם מהמסך תוצאות ImageJ. בעמודה השמאלית, להזין כל ערך ספיגת ידוע המתאימים כפי שמודפסת על האישור שקיבלת עם הלוח שלב מכוילת. סמן תיבות “כיול העולמי” עלילה “הצג” ולחץ על “אישור”. עבור בקרת איכות, לוודא R2 של הפונקציה Rodbard > 0.99. אם זה < 0.99, בדוק אם השקופיות כיול היו צולם, נמדד כראוי, האם הפרמטרים הידועים ספיגת הוזנו כהלכה. ImageJ עכשיו מכויל עד לסגירת התוכנית (ומכאן “כיול העולמי”). ספיגת מעבדתיים, הפעלה ImageJ מכויל תמיד ממירה שספיגת שנצפה חשובה ערכים בין 0 ל- 1, שבו 0 ו- 1 asymptotes של אפס, מלא ספיגת, בהתאמה. עבור cytospins, בחר > 100 תאים בודדים באופן אקראי. עבור מקטעים רקמות, בחר שדה אחד או יותר עניין של קבוע אורך ורוחב כל המקטעים. פרויקט רסטר מעל photomicrographs כדי לסייע תא לא משוחד הבחירות. ב- ImageJ, פרוייקט רשת מעל תמונה דרך תפריט רשת ← נתח ← תוספים. ב- ImageJ, להשתמש בכלי אליפטית כדי לבחור תאים בודדים, ולהשתמש בכלי מלבן כדי לבחור אזורי רקמות. למדוד את ספיגת ואזור של התאים שנבחרו או רקמות אזורים. צפיפות אופטית ואזור נקראים “מתכוון” ותוצאות “אזור” ב- ImageJ גיליון אלקטרוני, בהתאמה.הערה: ספיגת הכולל של אזור תאים או רקמות (אם בחרת במספר אזורים רקמות עם גדלים שונים) שווה לסכום של כל פיקסל מופרדים absorbances. אם תא עם תמונה ב- 1000 פיקסלים, לאחר מכן ספיגת סה כ ניתנת על ידי הסכום של 1000 absorbances, ספיגת כלומר ניתנת על ידי ספיגת סה כ/1000. הליך זה גם ימנע שגיאה בנפרד. לקבוע את ספיגת סה כ ממוצע של > 30 תאים או רקמות אזורים מ השקופיות שליטה, אשר מכיל מדגם זה נחשף לשלוט הדגירה בינוני בהיעדרו של המצע אלא בנוכחות cofactors. ספיגת פקד זה משמש כדי לשלוט מכתים פעילות האנזים שאינם ספציפיים, חפצי אמנות ספיגת המושרה על ידי שקופיות מיקרוסקופ רגיל, הרכבה בינונית, מכסה או מיקרוסקופ. להחסיר את ספיגת שליטה הממוצע של כל ספיגת סה כ המדידות של דגימות שנחשפו לבינונית הדגירה עם ריכוז זהה של קופקטור (אך ריכוזים שונים של המצע ו/או מעכב). זה נותן את ספיגת סה כ המתוקן של אזור תאים או רקמות. מבחינה סטטיסטית להשוות את absorbances הממוצע הכולל המתוקן באמצעות מבחן T של הסטודנט או מבחן ANOVA בכיוון אחד, בהתאם לעיצוב הניסיונית שלך. ספיגת Formazan יכולים להיות מומרים אנזים פעילות (המצע µmol המרה לכל מ”ל כל דקות) באמצעות החוק של למברט-בירה: c=A/(є×d), כאשר c הוא הריכוז של formazan בטווח הבינוני התגובה, A הוא ספיגת נמדד ב- ImageJ לאחר כיול; Є הוא המקדם הכחדה של formazan (16.000-585 ננומטר)8 ו- d הוא האור נוסע מרחק, אשר שווה ל עובי ממוצע התא או עובי חיתוך מקטע נומינלית (6-10 מיקרומטר ב פרוטוקול זה).הערה: לאחר ייבוש, העובי בסעיף רקמות תקטין ~ 50% מ עובי חיתוך מקטע נומינלית, אך זה לא משתקף בחישוב לעיל כי העובי חיתוך מקטע הנומינלית היא ביולוגית הרלוונטי ביותר. ניתן לקבוע את עובי ממוצע התא ואת הספרה ממדי תא preparates דבקה שקופיות זכוכית מיקרוסקופ באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית או מיקרוסקופ שדה רחב, אשר הפרוטוקולים ניתן למצוא במקום אחר. 9 , 10