Metabole Mapping: Kwantitatieve enzym cytochemie en histochemie te bepalen van de activiteit van Dehydrogenases in cellen en weefsels

Dit protocol volgt de richtsnoeren inzake het gebruik van menselijk materiaal van de medisch-ethische Review Board van het academisch medisch centrum. 1. bereiding van cellen of in weefselsecties Cellen Trypsinize cellen uit cultuur gerechten, gebruikmakend van 1 mL van 0,25% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een 10 mm petrischaal en brengen van cellen in een suspensie van 37 ° C van 50.000-200.000 cellen/mL, afhankelijk van de grootte van de cellen. Hechten 200 µL van de celsuspensie in microscopie dia’s met behulp van cytospin trechters in een cytocentrifuge bij 20 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. De cytospins gedurende 24 uur bij kamertemperatuur drogen. Dit heeft geen invloed op dehydrogenase activiteit. 5 Weefselsecties Uittreksel weefsel van patiënten of van dieren volgens ethische vergunningen. 10 mm3 van weefsel is voldoende voor meerdere experimenten. Zet de stukken van weefsel in kleine ontlucht 2 mL kunststof flesjes en module-freeze de flesjes met het stukje weefsel in vloeibare stikstof. Bewaar de flesjes met weefsel stuks op −80 ° C totdat zij worden verwerkt. Gebruik een medium van de gel-achtige genaamd optimale scherpe temperatuur (OCT) om te koppelen van het monster weefsel op een chuck dat tot-20 ° C tot-25 ° C, snel bevriest, zodat water kan zich geen kristallen vormen. Gebruik een cryostaat voor snijden en eerste trim het blok naar het gewenste niveau (idealiter de helft van de breedte van een microscopie glas dia, bijvoorbeeld 5 x 5 mm). Gebruik bij het segmenteren, borstels en een anti-roll plaat om te voorkomen dat de secties curling naar boven. Snijd weefselmonsters in 6-10 µm dik secties met een langzame maar constante snelheid (1 s per sectie). Wanneer een sectie correct wordt gesneden, blijft het plat op de microtoom mes onder de anti-roll-plaat. Neem 1-3 secties op microscopische glas dia’s en op −80 ° C bewaren tot gebruik. Het aantal secties bereid is afhankelijk van de grootte van de steekproef van het weefsel en de gewenste dikte van de secties. 2. enzym Histo/cytochemie voor oplosbare Dehydrogenases Voorbereiding reactie Buffer. 100 mL fosfaatbuffer van de juiste pH voor te bereiden (Zie tabel 1; elk enzym heeft een optimale pH waartegen de activiteit het hoogst is). Meng bijvoorbeeld oplossingen van 0,1 M KH2PO4 (zure) en 0,1 M NA2HPO4 (basis) tot een buffer met de juiste pH is gemaakt. Weeg 18 g van polyvinylalcohol (PVA) in de fosfaatbuffer onder een zuurkast zoals PVA stoffig en giftig is. Los van de 18% w/v PVA in de fosfaatbuffer bij 100 ° C door het opwarmen van de buffer au bain marie (zet de fles in kokend water) en roeren totdat het PVA volledig is opgelost. De oplossing zal zijn transparante vervolgens met kleine luchtbellen die worden veroorzaakt door de roeren. Het vereist meestal ~ 15 min voor het PVA te ontbinden.Opmerking: De 18% w/v PVA in fosfaatbuffer is viskeuze en 15 mL reactie buffer buizen met behulp van een precisiepipet breed kan worden overgedragen. Op korte termijn opslag van 18% w/v PVA in fosfaatbuffer plaatsvinden bij ≥40 ° C en langdurige opslag (maximaal 2 weken) op ≥ 60 ° C. 250 µL van 18% w/v PVA in fosfaatbuffer is doorgaans vereist voor een cytospin preparaat, terwijl 500 µL vereist voor een weefselsectie is. Bereid tetrazolium zout (nitroBT) oplossing. Voor elke 1 mL van incubatie medium, 40 µL van nitroBT oplossing vereist is, bestaande uit 5 mg nitroBT (een gele poeder) opgelost in een mix van 20 µL dimethylformamide (DMF) en 20 µL van ethanol, die een licht geel transparante oplossing zal zijn.Opmerking: Omdat de stabiliteit van nitroBT de laagste van alle nodige reagentia is, is het aanbevolen te bereiden de stockoplossing nitroBT laatst en los van de nitroBT in het medium reactie eerst. Los nitroBT in DMF en ethanol door verwarming van het in een glazen ampul gedurende een korte periode van tijd (~ 10 s) met behulp van een bunsenbrander. Schud de flacon tijdens verwarming en laat niet de flacon te lang in de vlam ter voorkoming van verdamping. Maken van 10% extra nitroBT oplossing voor de verdamping van DMF en ethanol tijdens het oplossen. Schild van de elektron vervoerders fenazine methosulfate (PMS) of (1-methoxy)-fenazine methosulfate (mPMS) en incubatie media met m(PMS) van direct licht door inwikkeling zilverpapier rond de glazen ampul voor opslag. Reagens oplossingen volgens tabel 1 voor te bereiden door hen in gedestilleerd H2O. Sommige reagentia vergaan snel, dus voor hen zo kort voor het experiment mogelijk te bereiden. Reagens oplossingen op ijs of bij 4 ° C houden tot gebruik. Bereiden van incubatie media zoals aangegeven in tabel 1 en meng de oplossing na elke stap door zachte roeren. Vermijd de generatie van luchtbellen in het incubatie-medium door onder voortdurend roeren en het houden van de spatel onder het oppervlak van het medium van de incubatie tijdens het roeren. Incubatie Medium toepassen weefselsecties Vooraf warm microscopie dia’s met cytospins of weefselsecties aangesloten bij 37 ° C in een immunohistochemistry incubatie zaal voor 15 min. onderdompelen de bodem van de kamer van de incubatie immunohistochemistry met warm water te handhaven van een constante temperatuur in de Incubator. Zorgvuldig breken of zag uit Pasteur pipetten op de overgang van de smalle naar het brede deel. Regelmatige Pasteur pipetten zijn te smal om te gecombineerd het visceuze incubatie medium, dus deze stap is nodig om Pasteur pipetten breed genoeg voor het streven van de incubatie-medium. 250-500 µL van het passende incubatie medium toepassen op elk preparaat van de cel of weefselsectie op microscopie dia’s met behulp van het brede deel van een pipet van Pasteur. Gebruik de pipet tip om het incubatie-medium gelijkmatig verdeeld. Negeer kleine luchtbellen in het incubatie-medium, omdat deze een werkbalk naar de oppervlakte zwevende wordt en niet met de enzymatische reactie in de cel voorbereiding weefsel sectie of op de dia microscopie interfereren zal. Incubeer de cel preparaten of weefselsecties op de microscopie dia’s in een 37 ° C incubator (bijvoorbeeld een incubator weefselkweek) gedurende een vooraf opgegeven, afhankelijk van de enzymkinetiek en haar expressie in een bepaalde cel preparaat of weefsel (tabel 1). Houd het deksel van de immunohistochemistry incubatie kamer gesloten te houden van een vochtige omgeving om te voorkomen dat de buffer reactie tegen het uitdrogen. Wassen van de microscopie dia ‘s Tik uit overtollige incubatie medium op een weefsel. Mechanisch spoel naar het medium van de incubatie van de microscopie dia’s in 60 ° C fosfaatbuffer, pH 5.3, door de microscopie dia’s in de buffer op en neer te bewegen. Hiermee stopt u de enzymatische reactie. De microscopie dia’s wassen door ze te houden in 60 ° C fosfaatbuffer, pH 5.3 voor 20 min. Mechanisch de microscopie dia’s in het water van de kraan van 60 ° C wassen. De microscopie dia’s wassen door ze te houden in het water van de kraan van de 60 ° C gedurende 20 minuten. Laat het water en dia’s koelen door het langzaam mengen van kamertemperatuur leidingwater met water uit de kraan 60 ° C in de loop van 1 minuut. Een definitieve mechanische wassen stap uitvoeren in kamertemperatuur gedistilleerd water. Omsluiten de gekleurde Cytospins of weefselsecties op microscopie dia ‘s Vooraf warm een dia warmer bij 50-60 ° C. Zorgvuldig droog van de achterkant van de microscopie dia’s met behulp van een papieren handdoek en leg ze op de dia warmer te drogen van de bovenzijde van de dia. microscopie. Als de dia’s droog zijn, moet u de cel preparaten of weefselsecties op microscopie dia’s met behulp van glycerol gelei montage medium en coverslips. De voorbereidingen van de cel of het weefsel secties microscopie dia’s opslaan in het donker in een koelkast bij 4 ° C of direct doorgaan met Beeldacquisitie. 3. de Beeldacquisitie Beelden van de record met een wetenschappelijke monochroom CCD camera met voldoende dynamisch bereik (ten minste 8-bit maar liefst 10-bit of 12-bits), vaste winst en een lineaire respons. Selecteer een eigenlijke doel (20 X-63 X voor cytospins) en 10-63 X voor weefselsecties. Verminder schittering door vernauwing van het veld middenrif zodat het is iets groter dan het gezichtsveld. Gebruik monochromatisch licht door een 10 nm breed bandpass gevolgtrekking filter in de buurt van de golflengte van de isobestic van de formazan overhaaste7 in combinatie met een infrarood blocking filteren (Zie Materialen tabel).Nota: De extinctie van de maximale isobestic van nitroBT is bij 585 nm. Optimaliseren van verlichting om ervoor te zorgen dat het hele grijze niveau bereik van de camera wordt gebruikt (dat wil zeggen, het niveau van de verlichting zo ingesteld dat maximum verlichtingssterkte wordt bereikt zonder teveel bloot bij het opnemen van een lege microscoopglaasje). Kalibreren gemeten grijze niveaus aan bekende extinctie (of optische dichtheid [OD]) waarden. Te dien einde vastleggen grijsschaal beelden van ten minste 10 verschillende stappen van een kalibratie dia of stap tablet met bekende OD-waarden (zie stap 4.1.1), ofwel verkrijgbare (Zie Materialen tabel) of meten van een op maat gemaakte grijsschaal wig stap tablet door een densitophotometer en gebruik de resultaten om te kalibreren gemeten grijs waarden naar bekende extinctie waarden. Photomicrographs van cellen of in weefselsecties van belang vastleggen. 4. de beeldanalyse Kalibreren voor beeldanalyse, de ImageJ software voor extinctie metingen. Meet de extinctie (OD) van photomicrographs van ten minste 10 kalibratie gebieden met bekende extinctie parameters in de kalibratie dia of stap tablet met bekende OD-waarden. In ImageJ, analyseren → maatregel menu of hotkey Ctrl + M om te meten van een geselecteerd gebied te gebruiken. Start de kalibratieprocedure absorptie door te gaan analyseren → kalibratie. Kies functie “Rodbard (NIH afbeelding)”. In de linkerkolom van het venster dat opent, zijn de resultaten van grijze niveaumetingen van elke stap van de kalibratie dia/stap tablet uitgevoerd in 4.1.1 al aanwezig. Als dat niet het geval is, hen te kopiëren van het scherm ImageJ resultaten. In de rechterkolom Geef elke overeenkomstige waarde van de bekende extinctie zoals afgedrukt op het certificaat dat u met de geijkte stap tablet ontvangen. Vink vakken “Global kalibratie” en “Show plot” en druk op “OK”. Voor kwaliteitscontrole, zorg ervoor dat de R2 van de Rodbard functie is > 0.99. Als het < 0,99, controleren of de kalibratie dia's werden gefotografeerd en correct gemeten en of de bekende extinctie parameters correct werden opgenomen. ImageJ is nu gekalibreerd totdat u het programma sluit (vandaar “Global kalibratie”). Voor extinctie metingen, een gekalibreerde ImageJ sessie altijd converteert die de waargenomen extinctie betekent naar waarden tussen 0 en 1, waarbij 0 en 1 zijn de asymptoten van nul en volledige absorptie, respectievelijk. Voor cytospins, selecteert u > 100 afzonderlijke cellen in een willekeurige manier. Voor weefselsecties, selecteert u een of meer velden van belang van een vaste lengte en breedte in alle secties. Project een raster over de photomicrographs bij onbevooroordeelde cel selecties. Project in ImageJ, een rooster boven een afbeelding via het menu → raster van Plugins → analyseren. In ImageJ, het elliptisch gereedschap gebruiken om enkele cellen te selecteren en gebruik het gereedschap rechthoek om te selecteren van de regio’s van weefsel. Het meten van de absorptie en de oppervlakte van de geselecteerde cellen of weefsel regio’s. De optische dichtheid en gebied heten “Mean” en “Ruimte” in de ImageJ resultaten werkblad, respectievelijk.Opmerking: De totale extinctie van een cel of een weefsel regio (als u meerdere weefsel regio’s met verschillende formaten hebt geselecteerd) is gelijk aan de som van alle gescheiden pixel verticaal absorptie. Als een cel is beeld door 1000 pixels, dan de totale extinctie wordt gegeven door de som van 1000 verticaal absorptie en de gemiddelde absorptie wordt gegeven door totale absorptie/1000. Deze procedure ook vermeden verdeling fout. Bepalen van de gemiddelde totale extinctie van > 30 cellen of weefsel regio’s van de dia(‘s) control, waarin een monster dat werd blootgesteld aan de controle van incubatie medium in de afwezigheid van substraat maar in aanwezigheid van cofactoren. De extinctie van deze controle is gebruikt om te controleren voor niet-specifieke enzym activiteit kleuring en absorptie artefacten geïnduceerd door de gebruikte microscopie dia’s, montage medium, cover slip of Microscoop. Aftrekken van de extinctie van de controle van de gemiddelde van alle metingen van de totale extinctie van monsters die werden blootgesteld aan incubatie medium met dezelfde concentratie van cofactor (maar verschillende concentraties substraat of remmer). Dit geeft de gecorrigeerde totale extinctie van een cel of een weefsel regio. Statistisch vergelijken verticaal de gemiddelde gecorrigeerde totale absorptie met behulp van de Student T-test of one-way ANOVA, afhankelijk van uw experimentele ontwerp. Formazan absorptie kan worden omgezet in de enzym activiteit (µmol geconverteerd substraat per mL / min) via de wet van Lambert-Beer: c=A/(є×d), indien c is de concentratie van formazan in het reactie-medium, A is de gemeten extinctie in ImageJ na kalibratie; Є is de coëfficiënt uitsterven van formazan (16.000 op 585 nm)8 en d is het licht reizen afstand, die gelijk aan de gemiddelde cel dikte of nominale sectie snijdikte (6-10 µm in dit protocol is).Opmerking: Na het drogen wordt de dikte van de sectie weefsel vermindert ~ 50% van de nominale sectie snijdikte, maar dit wordt niet weerspiegeld in de berekening hierboven omdat de nominale sectie snijdikte biologisch het meest relevant zijn is. De gemiddelde cel dikte en de sfeer afmetingen van cel preparaten nageleefd microscopie glas dia’s kunnen worden bepaald met behulp van de confocal microscopie of breed-gebied microscopie, waarvoor protocollen kunnen elders worden gevonden. 9 , 10