Надежные ДНК изоляции и высокопроизводительного секвенирования строительство библиотеки для образцов гербария

Гербарий коллекции являются потенциально ценным источником как видов, так и геномного разнообразия для исследований, включая филогенетики^1,2,3, популяционной генетики^4,5, сохранению Биология⁶, инвазивные виды биологии⁷и черта эволюции⁸. Возможность получения богатого разнообразия видов, популяций, географических точках, и моменты времени подчеркивает «сундук»⁹ это гербария. Исторически деградированных характер гербарий, полученных ДНК препятствовало ПЦР-проектов на базе, часто relegating исследователей с использованием только маркеры в высокой копии, например регионов геномом хлоропластов или внутренней трансляции распорку (СТС) о рибосомных РНК. Качества образцов и ДНК широко зависят методы сохранения^9,10, с двуцепочечные разрывы и фрагментации от жары, используемых в процессе сушки, будучи наиболее распространенных форм ущерба, создание так называемые 90% ДНК карцер, заполнена на основе ПЦР исследования¹¹. Помимо фрагментации второй наиболее распространенной проблемой в гербарий геномики является загрязнение, такие как, производный от эндофитные грибов¹³ или грибов приобрел посмертных после сбора, но до монтажа в гербарий¹², хотя Эта проблема может быть выполнено bioinformatically, учитывая право грибковых базы данных (см. ниже). Третий и менее распространенные, проблема изменения последовательности через цитозина дезаминирование (C/G→T/A)¹⁴, хотя он считается низкой (~ 0.03%) в гербарий образцов¹¹. С появлением высокопроизводительного секвенирования (HTS) вопрос о фрагментации может быть преодолена с короткой читает и последовательности глубины^12,15, позволяя геномных данных приобретение от многочисленных образцов с низким качеством ДНК и иногда даже разрешительные весь геном последовательности¹⁵.

Гербарий образцы становится все более часто используются и более крупный компонент филогенетических проектов¹⁶. Текущий вызов с использованием образцов гербария для HTS неизменно является получение достаточных двойной мель ДНК, является необходимым условием для последовательность протоколов, от многочисленных видов своевременно, без необходимости оптимизации методов для отдельных образцы. В этом документе протокол для экстракции ДНК и библиотека подготовки образцов гербария показано что использует преимущества существующих методов и изменяет их для быстрого и воспроизводимые результаты. Этот метод позволяет для полной обработки от образца к библиотеке 24 пробы в 13 h, с 8 h практическое время, или 16 h, с 9 ч практический время, когда требуется дополнительный reamplification шаг. Одновременная обработка более образцов является достижимым, хотя ограничивающим фактором является мощности центрифуг и технических навыков. Протокол призван требовать только в типичных лабораторное оборудование (Термоциклер, центрифуги и магнитные стенды) вместо специализированного оборудования, такие как распылитель или sonicator, для сдвига ДНК.

Размер фрагментов ДНК качество и количество сдерживающими факторами для использования образцов гербария в высокопроизводительного секвенирования экспериментов. Другие методы для изоляции гербарий ДНК и создания высокопроизводительного секвенирования библиотек продемонстрировали полезность использования как мало, как 10 нг¹⁶ДНК; Однако они требуют экспериментально определить оптимальное количество PCR циклов, необходимых для подготовки библиотеки. Это становится нецелесообразным, когда решения с весьма небольшим количеством жизнеспособных двойной мель ДНК (dsDNA), как некоторые образцы гербарий производят только достаточное количество ДНК для приготовления одной библиотеки. Метод, представленные здесь использует единый количество циклов независимо от качества образцов, поэтому не ДНК теряется в шагов оптимизации библиотеки. Вместо этого шаг reamplification вызывается, когда библиотеки не соответствуют минимальной суммы, необходимой для виртуализации. Многие образцы гербарий редки и имеют мало материала, что делает его трудно оправдать разрушительной выборки во многих случаях. Чтобы противостоять этому, представленный протокол позволяет dsDNA ввода размеров менее 1,25 нг в процесс подготовки Библиотека, расширение сферы применения жизнеспособных образцов для высокопроизводительного секвенирования и свести к минимуму потребность в разрушительной выборки образцов.

Следующий протокол оптимизирован для трав и протестированы на сотни различных видов из образцов гербария, хотя мы ожидаем, что протокол может применяться для многих других групп растений. Она включает в себя шаг необязательный восстановления, который может использоваться для сохранения низкого качества или редких образцов. Основываясь на более чем двух сотен гербарий образцов испытания, этот протокол работает на образцах с низкой ткани ввода и качества, позволяя для сохранения редких образцов через минимальным разрушительным выборки. Здесь показано, что этот протокол может обеспечить высокое качество библиотек, которые можно упорядочивать для проектов на базе phylogenomics.