Isolement d’ADN robuste et Construction de bibliothèque de séquençage haut-débit pour les spécimens d’herbier

Collections de l’herbier sont une source potentiellement utile des deux espèces et la diversité génomique d’études y compris phylogénétique^1,2,3, génétique des populations,^4,5, conservation biologie⁶espèces envahissantes biologie⁷et trait evolution⁸. La possibilité d’obtenir une riche diversité d’espèces, populations, lieux géographiques et points dans le temps met en lumière le « treasure chest »⁹ qui est de l’herbier. Historiquement, la nature dégradée de l’ADN dérivé herbier a entravé les projets axés sur la PCR, reléguant souvent les chercheurs à utiliser uniquement les marqueurs trouvés à élevé de copies, comme les régions du génome chloroplastique ou l’espaceur interne transcrit (ITS) de le ribosomique ARN. Qualité des spécimens et ADN varient largement basé sur les méthodes de préservation^9,10, avec des cassures double-brin et la fragmentation de la chaleur utilisée dans le processus de séchage étant les formes les plus courantes des dommages, la création du ce que l’on appelle 90 % ADN de lock-up qui a grevé les études basées sur la PCR¹¹. En dehors de la fragmentation, deuxième plus répandu en génomique de l’herbier s’agit de contamination, telles que cette dérivée de champignons endophytes¹³ ou champignons acquis post mortem après la collecte mais avant de monter dans l’herbier¹², bien que ce problème peut être résolu bioinformatically compte tenu de la base de données droit fongique (voir ci-dessous). Un troisième problème, moins fréquents, est la modification de séquence par le biais de cytosine désamination (C/G→T/A)¹⁴, bien qu’on estime être faible (~ 0,03 %) à l’herbier spécimens¹¹. Avec l’avènement de séquençage haut débit (HTS), la question de la fragmentation peut être surmontée avec quelques lectures et séquençage profondeur^12,15, permettant l’acquisition des données génomiques des nombreux spécimens de faible qualité L’ADN et parfois même permettre de séquençage du génome entier¹⁵.

Des échantillons d’herbier sont devenant plus fréquemment utilisés et sont une plus grande partie des projets phylogénétique¹⁶. Un défi actuel de l’utilisation de spécimens d’herbier pour HTS est systématiquement obtenir suffisamment ADN bicaténaire, indispensable pour les protocoles de séquençage, de nombreuses espèces dans un délai raisonnable, sans avoir besoin d’optimiser des méthodes pour l’individu spécimens. Dans cet article, un protocole d’extraction d’ADN et préparation de la bibliothèque de spécimens d’herbier démontre qui tire profit des méthodes existantes et modifie leur permettant des résultats rapides et reproductibles. Cette méthode permet complète transformation du spécimen dans une bibliothèque de 24 échantillons à 13 h, avec temps de pratique 8 h, ou 16 h, avec le temps de pratique 9 h, quand l’étape facultative reamplification est nécessaire. Traitement simultané de plusieurs échantillons est réalisable, même si le facteur limitant est la capacité de centrifugeuse et de compétences techniques. Le protocole vise à exiger uniquement matériel de laboratoire typique (thermocycleur, centrifugeuse et supports magnétiques) au lieu de l’équipement spécialisé, comme un nébuliseur ou un sonicateur, pour la tonte de l’ADN.

Qualité de l’ADN, taille du fragment et la quantité sont des facteurs d’utilisation des spécimens d’herbier dans les expériences de séquençage haut débit limitant. Autres méthodes pour isoler l’ADN de l’herbier et création de bibliothèques de séquençage haut débit ont démontré l’utilité d’utiliser aussi peu que 10 ng d’ADN¹⁶; Cependant ils ont besoin de déterminer expérimentalement le nombre optimal de PCR cycles requis pour la préparation de la bibliothèque. Cela devient impraticable lorsque traitant de très petites quantités de double viable stranded DNA (ADN double brin), car certains spécimens d’herbier produisent seulement assez ADN pour une préparation de bibliothèque unique. La méthode présentée ici utilise un numéro unique de cycles indépendamment de la qualité de l’échantillon, donc aucun ADN ne se perd dans les étapes d’optimisation de bibliothèque. Au lieu de cela, une étape de reamplification est appelée lorsque les bibliothèques ne respectent pas les montants minimums nécessaires pour l’ordonnancement. De nombreux échantillons d’herbier sont rares et possèdent peu de matériel rendant difficile de justifier l’échantillonnage destructeur dans de nombreux cas. Pour contrer cela, le protocole présenté permet de dsDNA entrée tailles moins de 1,25 ng dans le processus de préparation de bibliothèque, élargit la portée des échantillons viables pour haut débit séquençage et réduisant au minimum la nécessité d’échantillonnage destructeur des spécimens.

Le protocole suivant a été optimisé pour les graminées et testé sur des centaines d’espèces différentes des échantillons d’herbier, même si nous attendons que le protocole peut être appliqué à beaucoup d’autres groupes de plantes. Il comprend une étape de récupération en option qui peut être utilisée pour enregistrer la basse qualité et/ou des spécimens rares. Après plus de deux cents spécimens d’herbier testés, ce protocole fonctionne sur des spécimens avec faible tissu d’entrée et de qualité, permettant la préservation des spécimens rares par échantillonnage destructeur minime. Ici, il est démontré que ce protocole peut fournir des bibliothèques de haute qualité qui peuvent être séquencés pour projets axés sur la phylogénomique.