Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Herbarium collecties zijn een potentieel waardevolle bron van zowel de soorten en de genomische diversiteit voor studies inclusief fylogenie^1,2,3, populatie genetica^4,5, instandhouding biologie⁶, invasieve soorten biologie⁷en trek evolutie⁸. De mogelijkheid om het verkrijgen van een rijke diversiteit aan soorten, populaties, geografische locaties en tijdstippen hoogtepunten de “schatkamer”⁹ thats het herbarium. Historisch, heeft de aangetaste aard van herbarium afkomstige DNA PCR-gebaseerde projecten, vaak indelings onderzoekers aan het gebruik van alleen markeringen gevonden in hoge exemplaar, zoals regio’s van de chloroplast genoom- of de interne getranscribeerde spacer (ITS) voor de ribosomal belemmerd RNA. Kwaliteit van specimens en DNA variëren uitgebreid op basis van methoden van behoud^9,10, met double-stranded pauzes en versnippering van warmte in het droogproces wordt de meest voorkomende vormen van schade, het creëren van gebruikt de zogenaamde 90% DNA lock-up die PCR gebaseerde studies¹¹heeft bezwaard. Afgezien van fragmentatie is het tweede meest voorkomende probleem in herbarium genomics besmetting, zoals die afkomstig is van endophytic schimmels¹³ of schimmels postmortale verworven na collectie maar vóór de montage in het herbarium¹², hoewel Dit probleem kan worden opgelost bioinformatically gegeven de juiste schimmel database (zie hieronder). Een derde, en minder vaak, probleem is wijziging van de volgorde via cytosine (C/G→T/A) deamination¹⁴, hoewel het wordt geschat op lage (~ 0,03%) in herbarium specimens¹¹. Met de komst van high-throughput sequencing (HTS), kan het probleem van de versnippering worden overwonnen met korte leest en sequencing diepte^12,15, waardoor genomic-niveau data-acquisitie van talrijke exemplaren met lage kwaliteit DNA, en soms zelfs het hele genoom sequencing¹⁵toelaat.

Herbarium monsters worden steeds vaker gebruikt en zijn een grotere component fylogenetische projecten¹⁶. Een uitdaging van dit moment herbarium exemplaren te gebruiken voor HTS is consequent voldoende dubbele gestrande DNA, een noodzakelijke voorwaarde voor sequencing protocollen, verkrijgen van talrijke soorten in een tijdig, zonder te optimaliseren van methoden voor het individu exemplaren. In deze paper wordt een protocol voor DNA-extractie en bibliotheek voorbereiding van herbarium specimens die profiteert van bestaande methoden en hen te voorzien van snelle en repliceerbaar resultaten wijzigt aangetoond. Deze methode zorgt voor volledige verwerking vanaf specimen aan een bibliotheek voor 24 samples in 13 h, met 8 h hands-on tijd, of 16 h, met 9 h hands-on tijd, wanneer de optionele reamplification stap nodig is. Gelijktijdige verwerking van meer monsters is haalbaar, al is de beperkende factor centrifuge capaciteit en technische vaardigheid. Het protocol is ontworpen om alleen typische laboratoriumapparatuur (thermocycler centrifuge en magnetische stands) in plaats van gespecialiseerde apparatuur, zoals een vernevelaar of ultrasoonapparaat, voor het scheren van DNA vereisen.

DNA kwaliteit, fragment grootte en het aantal beperken factoren voor het gebruik van herbarium specimens in high-throughput sequencing experimenten. Andere methoden voor het isoleren van herbarium DNA en het maken van high-throughput sequencing bibliotheken hebben aangetoond dat het nut van het gebruik van zo weinig als 10 ng DNA¹⁶; maar ze vereisen het optimale aantal PCR experimenteel te bepalen cycli vereist voor de voorbereiding van de bibliotheek. Dit wordt onpraktisch als omgaan met buitengewoon kleine hoeveelheden van levensvatbare dubbele strandde DNA (dsDNA), zoals sommige herbarium exemplaren alleen voldoende DNA voor een preparaat één bibliotheek produceren. De methode die hier gepresenteerd maakt gebruik van een enkel getal van cycli ongeacht monster kwaliteit, dus geen DNA is verloren in bibliotheek optimization stappen. In plaats daarvan, is een stap in de reamplification wordt aangeroepen wanneer bibliotheken niet voldoen aan de minimale bedragen die nodig zijn voor het rangschikken. Vele herbarium monsters zijn zeldzaam en weinig materiaal, waardoor het moeilijk te rechtvaardigen destructieve bemonstering in veel gevallen bezitten. Om dit tegen te, kunt het gepresenteerde protocol dsDNA ingang maten van minder dan 1,25 ng in het voorbereidingsproces van de bibliotheek, uitbreiding van het toepassingsgebied van levensvatbare monsters voor high-throughput sequencing en het minimaliseren van de noodzaak voor destructieve bemonstering van specimens.

Het volgende protocol is geoptimaliseerd voor grassen en getest op honderden verschillende soorten van herbarium monsters, hoewel we verwachten dat het protocol kan worden toegepast op vele andere plantengroepen. Het bevat een optionele herstelstap, die kan worden gebruikt voor het opslaan van lage kwaliteit en/of zeldzame exemplaren. Gebaseerd op meer dan tweehonderd herbarium exemplaren getest, werkt dit protocol op monsters met lage weefsel input en kwaliteit, waardoor het behoud van zeldzame specimens via minimale destructieve bemonstering. Hier is het aangetoond dat dit protocol kan bieden hoge kwaliteit Bibliotheken, die kunnen worden sequenced voor phylogenomics gebaseerde projecten.