Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling
Summary
Regulación traduccional desempeña un papel importante en el control de la abundancia de la proteína. Aquí, describimos un método de alto rendimiento para el análisis cuantitativo de la traducción en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
Traducción de mRNA en las proteínas es un proceso complejo que involucra varias capas de regulación. A menudo se asume que cambios en la transcripción del mRNA reflejan cambios en la síntesis de proteínas, pero se han observado muchas excepciones. Recientemente, una técnica llamada ribosoma perfiles (o Ribo-Seq) ha surgido como un método eficaz que permite la identificación, con gran precisión, que las regiones de ARNm se traducen en proteínas y cuantificación de la traducción a nivel de todo el genoma. Aquí, presentamos un protocolo generalizado para la cuantificación del genoma de la traducción con Ribo-Seq en levadura de florecimiento. Además, combinando datos de Ribo-Seq con mediciones de abundancia de ARNm permite al mismo tiempo cuantificar la eficiencia de la traducción de miles de transcripciones del mRNA en la misma muestra y comparar cambios en estos parámetros en respuesta a experimental manipulaciones o en los diferentes Estados fisiológicos. Se describe un protocolo detallado para la generación de huellas de ribosoma mediante digestión de nucleasa, aislamiento de complejos ribosoma-huella intacta vía fraccionamiento gradiente de sacarosa y la preparación de las bibliotecas de ADN para secuenciación profunda junto con el apropiado controles de calidad necesarios para asegurar un análisis preciso de la traducción en vivo .
Introduction
traducción del mRNA es uno de los procesos fundamentales en la célula, que desempeña un papel importante en la regulación de la expresión de la proteína. Por lo tanto, traducción del mRNA es firmemente controlada en respuesta a diferentes estímulos fisiológicos internos y externos 1,2. Sin embargo, los mecanismos de regulación traduccional siendo estudiados. Aquí, describimos el protocolo para la cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por ribosome profiling. El objetivo general de la técnica de generación de perfiles de ribosoma es estudiar y cuantificar la traducción de mRNAs específicos bajo condiciones celulares diferentes. Esta técnica utiliza la secuenciación de próxima generación para analizar cuantitativamente la ocupación del ribosoma a lo largo del genoma y permite el control de la tasa de proteína síntesis en vivo en el codón solo resolución 3,4. Actualmente, este método proporciona los medios más avanzados de medición de los niveles de la traducción de la proteína y ha demostrado para ser una herramienta de descubrimiento útil proporcionar información que no puede ser revelado por otras técnicas actualmente disponibles, por ejemplo a microarrays o traducción en estado matriz análisis (TSAA) 5. Como perfiles de informes sobre los cambios combinados en los niveles de transcripción y traslación salida del ribosoma, también proporciona mucha mayor sensibilidad en comparación con otros métodos.
Este enfoque se basa en profunda secuenciación de fragmentos de ARNm ribosoma protegido 3. Durante la traducción de proteínas, los ribosomas protegen ~ 28 porciones del nt de los mRNA (llamado huellas) 6. Mediante la determinación de la secuencia de los fragmentos protegidos por el ribosoma, Ribo-Seq puede mapa la posición del ribosoma sobre el ARNm traducidos e identificar qué regiones del mRNA están probables que activamente ser traducido en proteína 3,7. Además, podemos medir cuantitativamente la traducción del mRNA contando el número de huellas que se alinean a una transcripción de mRNA dado.
Para aislar los fragmentos protegidos por el ribosoma, lysates de la célula son inicialmente tratados con un inhibidor de la traducción para atascar los ribosomas seguidos por digestión de la ribonucleasa. Mientras que libres mRNA y porciones de mRNAs traducido no protegidos por los ribosomas son degradadas por la ribonucleasa, los fragmentos de ARNm ribosoma protegidos pueden ser recuperados por purificación complejos ribosoma-huella intacta. Estas huellas de mRNA son entonces convertidas en biblioteca del cDNA y analizaron por secuenciación profunda (figura 1). En paralelo a ribosome profiling, mRNA intacto es extraído de la misma muestra y ordenados. Al comparar el nivel de traducción identificado por Ribo-Seq con mediciones de abundancia del mRNA, podemos identificar los genes que son específicamente para arriba o abajo-regulados a nivel de la traducción y calcular la eficiencia de traducción de mRNA en el nivel de todo el genoma. Mientras que el protocolo descrito en este artículo es específico para la levadura, debe ser también útil para los investigadores que tratan de establecer el protocolo de Ribo-Seq en otros sistemas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El enfoque de Ribo-Seq ha emergido como una tecnología de gran alcance para el análisis de mRNA traducción en vivo en el nivel 3de todo el genoma. Estudios con este enfoque, que permite el control de traducción con codón solo resolución, ha contribuido a nuestra comprensión de la regulación traduccional. A pesar de sus ventajas, Ribo-Seq tiene varias limitaciones. Fragmentos de ARN ribosómico (ARNr) son siempre Co purificados durante el aislamiento de huellas protegido ribosoma d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de becas en salud AG040191 y AG054566 a VML. Esta investigación se llevó a cabo mientras VML recibió una beca de investigación lejos de la American Federation for Aging Research.
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
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