Genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung
Summary
Translational Regelung spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von Protein Fülle. Hier beschreiben wir eine Hochdurchsatz-Methode zur quantitativen Analyse der Übersetzung in der angehenden Hefe Saccharomyces Cerevisiae.
Abstract
Übersetzung von mRNA in Proteine ist ein komplexer Prozess mit mehreren Schichten der Verordnung. Es wird oft angenommen, dass Veränderungen in der mRNA-Transkription in der Proteinsynthese Änderungen, aber viele Ausnahmen eingehalten worden. Vor kurzem hat sich eine Technik namens Ribosom Profilierung (oder Ribo-Seq) eine leistungsfähige Methode entwickelt, die Identifizierung, mit hoher Genauigkeit ermöglicht, welche Regionen der mRNA in Proteine und Quantifizierung des Übersetzungsdienstes der Genom-weite Ebene umgesetzt werden. Hier präsentieren wir Ihnen eine generalisierte Protokoll für genomweite Quantifizierung der Übersetzung mittels Ribo-Seq angehende Hefe. Darüber hinaus ermöglicht Kombination Ribo-Seq-Daten mit mRNA Fülle Messungen gleichzeitig Übersetzung Effizienz von Tausenden von mRNA Transkripte in der gleichen Probe zu quantifizieren und Änderungen dieser Parameter als Reaktion auf experimentelle vergleichen Manipulationen oder in verschiedenen physiologischen Zuständen. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung von Ribosom Fußabdrücke mit Nuklease Verdauung, Isolierung von intakten Ribosom-Fußabdruck-komplexe über Saccharose gradient Fraktionierung und Vorbereitung von DNA-Bibliotheken für tiefe Sequenzierung zusammen mit entsprechenden Qualitätskontrollen notwendig, genaue Analyse der in Vivo Übersetzung zu gewährleisten.
Introduction
mRNA Übersetzung ist eines der grundlegenden Prozesse in der Zelle, die eine wichtige bei der Regulierung der Proteinexpression Rolle. Daher wird die mRNA Übersetzung als Reaktion auf verschiedene interne und externe physiologischen Reize 1,2streng kontrolliert. Allerdings bleiben die Mechanismen der translationalen Verordnung erforschten. Hier beschreiben wir das Protokoll für die genomweite Quantifizierung der Übersetzung in der angehenden Hefe durch Ribosom Profilierung. Das übergeordnete Ziel der Ribosom Profilerstellungs-Technik ist, zu studieren und die Übersetzung von spezifischen mRNAs unter verschiedenen zellulären Bedingungen zu quantifizieren. Diese Technik nutzt Next Generation Sequencing, um Ribosom Belegung im gesamten Genom quantitativ zu analysieren und ermöglicht die Überwachung der Rate des Protein-Synthese in Vivo auf der einzigen Codon Resolution 3,4. Derzeit, diese Methode bietet die modernsten Mittel zur Messung der Niveaus von Protein Übersetzung und hat sich als ein nützliches Discovery-Tool die Informationen, die von anderen derzeit verfügbaren Techniken, z.B. Microarrays offenbart werden kann nicht oder Übersetzung Status Array-Analyse (TSAA) 5. Als Ribosom Profilierung Berichte über die kombinierte Veränderungen in Abschrift Ebenen und translationale Ausgabe bietet es auch viel mehr Sensibilität gegenüber anderen Methoden.
Dieser Ansatz basiert auf Tiefe Sequenzierung des Ribosom-geschützte mRNA Fragmenten 3. Während der Protein-Übersetzung, Ribosomen zu schützen ~ 28 nt Teile der mRNA (so genannte Fußabdrücke) 6. Durch die Bestimmung der Reihenfolge der Fragmente Ribosom geschützt, kann Ribo-Seq ordnen Sie die Position der Ribosomen auf die übersetzten mRNA und ermitteln, welche Regionen der mRNA Protein 3,7aktiv übersetzt werden dürften. Darüber hinaus können wir die Übersetzung von mRNA quantitativ messen, durch zählen der Anzahl der Spuren, die zu einem bestimmten mRNA-Transkript ausgerichtet.
Um das Ribosom-geschützten Fragmente zu isolieren, sind Zelle Lysates zunächst mit einem Inhibitor der Übersetzung, die Ribosomen, gefolgt von Ribonuklease Verdauung stall behandelt. Während kostenlose mRNA und Teile der übersetzten mRNAs nicht geschützt von Ribosomen von Ribonuklease abgebaut werden, können die Ribosom geschützt mRNA Fragmenten durch Reinigung intakten Ribosom-Fußabdruck-komplexe wiederhergestellt werden. Diese mRNA Fußabdrücke sind dann in cDNA Bibliothek umgewandelt und durch tiefe Sequenzierung (Abbildung 1) analysiert. Parallel zur Profilerstellung Ribosom ist intakt mRNA aus derselben Probe extrahiert und sequenziert. Durch Vergleich des Übersetzung von Ribo-Seq mit mRNA Fülle Messungen identifiziert, können wir identifizieren Gene, speziell Up – oder Down-reguliert auf der Ebene der Übersetzung und Übersetzung Effizienz der mRNA auf Genom-weite Ebene zu berechnen. Während des Protokolls, die in diesem Artikel beschriebenen spezifisch für Hefe ist, sollte es auch nützlich für Forscher, die versuchen, das Ribo-Seq-Protokoll in andere Systeme zu etablieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Ribo-Seq-Ansatz ist eine leistungsstarke Technologie für die Analyse von mRNA Übersetzung in Vivo bei der Genom-weite Ebene 3entstanden. Studien mit diesem Ansatz, der ermöglicht die Überwachung von Übersetzung mit Single-Codon Auflösung, hat zu unserem Verständnis der translational Regelung beigetragen. Trotz seiner Vorteile hat Ribo-Seq mehrere Einschränkungen. Ribosomale RNA (rRNA) Fragmente sind immer Co gereinigten während Isolierung des Ribosom-geschützte Fußabdrücke…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health Stipendien, AG040191 und AG054566, VML unterstützt. Diese Studie wurde durchgeführt, während VML ein AFAR Research Grant von der American Federation for Aging Research erhielt.
Materials
| 0.45 μM membrane filters | Millipore | HVLP04700 | |
| 0.5 M EDTA | Invitrogen | AM9261 | |
| 0.5 mL centrifugal filters (100 kDa MWCO) | Millipore | UFC510024 | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.0 | Invitrogen | AM9850G | |
| 1 M Tris-HCl, pH 7.5 (pH 8.0 at 4°C) | Invitrogen | 15567-027 | |
| 10X TBE buffer | Invitrogen | AM9863 | |
| 10% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6875BOX | |
| 15% TBE-urea gel | Invitrogen | EC6885BOX | |
| 2 M MgCl2 | RPI | M24500-10.0 | |
| 2X TBE-urea sample buffer | Invitrogen | LC6876 | |
| 3M NaOAc, pH 5.5 | Invitrogen | AM9740 | |
| 5' Deadenylase (10 U/μL) | Epicentre | DA11101K | |
| 5X Nucleic acid sample loading buffer | Bio-Rad | 161-0767 | |
| 8% TBE gel | Invitrogen | EC6215BOX | |
| Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) | Invitrogen | AM9722 | |
| Blue light transilluminator | Clare Chemical Research | DR-46B | |
| Chrome-steel beads, 3.2 mm | BioSpec Products | 11079132c | |
| Cryogrinder | Biospec product | 3110BX | |
| Cycloheximide | RPI | C81040-5.0 | |
| Data Acquisition System | DATAQ Instruments | DI-245 | |
| Deoxynucleotide (dNTP) solution mix (10 mM) | NEB | N0447L | |
| Glycogen | Invitrogen | AM9510 | |
| Gradient fractionation system | Brandel | BR-184X | |
| High-fidelity DNA polymerase (2,000 U/mL) | NEB | M0530S | Supplied with 5X Phusion HF Buffer |
| Next-generation sequencing library quantification kit | Kapa Biosystems | KK4824 | |
| Nucleic acid gel stain | Invitrogen | S11494 | |
| Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
| Poly(A) mRNA isolation kit | Invitrogen | 61011 | |
| Rec J exonuclease (10 U/μL) | Epicentre | RJ411250 | |
| Reverse transcriptase (200 U/μL) | Invitrogen | 18080093 | Supplied with 5X first-strand buffer and 0.1 M DTT |
| RNA fragmentation buffer | NEB | E6186A | |
| RNase I (100 U/μL) | Invitrogen | AM2295 | |
| RNase inhibitor (20 U/μL) | Invitrogen | AM2696 | |
| Silicone rubber caps | BioSpec Products | 2008 | |
| ssDNA ligase (100 U/μL) | Epicentre | CL9021K | Supplied with 10X CircLigase II buffer and 50 mM MnCl2 |
| Stainless steel microvials, 1.8 mL | BioSpec Products | 2007 | |
| Sucrose | RPI | S24060-5000.0 | |
| SW-41 Ti rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| T4 polynucleotide kinase (10,000 U/mL) | NEB | M0201S | Supplied with 10X T4 polynucleotide kinase buffer |
| T4 RNA ligase 2 truncated KQ (200,000 U/mL) | NEB | M0373S | Supplied with 10X T4 RNA ligase buffer and 50% PEG8000 |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1851148 | |
| Thinwall polyallomer tubes, 13.2 mL | Beckman Coulter | 331372 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | |
| UV monitor | Bio-Rad | 7318160 | |
| Saccharomyces cerevisiae strain BY4741 | Open Biosystems | YSC1048 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Tanenbaum, M. E., Stern-Ginossar, N., Weissman, J. S., Vale, R. D. Regulation of mRNA translation during mitosis. Elife. 4, (2015).
- Ingolia, N. T., Ghaemmaghami, S., Newman, J. R., Weissman, J. S. Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science. 324 (5924), 218-223 (2009).
- Ingolia, N. T. Genome-wide translational profiling by ribosome footprinting. Methods Enzymol. 470, 119-142 (2010).
- Brar, G. A., Weissman, J. S. Ribosome profiling reveals the what, when, where and how of protein synthesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (11), 651-664 (2015).
- Wolin, S. L., Walter, P. Ribosome pausing and stacking during translation of a eukaryotic mRNA. EMBO J. 7 (11), 3559-3569 (1988).
- Guo, H., Ingolia, N. T., Weissman, J. S., Bartel, D. P. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466 (7308), 835-840 (2010).
- Ingolia, N. T., Brar, G. A., Rouskin, S., McGeachy, A. M., Weissman, J. S. The ribosome profiling strategy for monitoring translation in vivo by deep sequencing of ribosome-protected mRNA fragments. Nat Protoc. 7 (8), 1534-1550 (2012).
- Bartholomaus, A., Del Campo, C., Ignatova, Z. Mapping the non-standardized biases of ribosome profiling. Biol Chem. 397 (1), 23-35 (2016).
- Larsson, O., Sonenberg, N., Nadon, R. anota: Analysis of differential translation in genome-wide studies. Bioinformatics. 27 (10), 1440-1441 (2011).
- Zhong, Y., et al. RiboDiff: detecting changes of mRNA translation efficiency from ribosome footprints. Bioinformatics. 33 (1), 139-141 (2017).
- Xiao, Z., Zou, Q., Liu, Y., Yang, X. Genome-wide assessment of differential translations with ribosome profiling data. Nat Commun. 7, 11194 (2016).
- Chung, B. Y., et al. The use of duplex-specific nuclease in ribosome profiling and a user-friendly software package for Ribo-seq data analysis. RNA. 21 (10), 1731-1745 (2015).
- Popa, A., et al. RiboProfiling: a Bioconductor package for standard Ribo-seq pipeline processing. F1000Res. 5, 1309 (2016).
- Dunn, J. G., Weissman, J. S. Plastid: nucleotide-resolution analysis of next-generation sequencing and genomics data. BMC Genomics. 17 (1), 958 (2016).
- Baranov, P. V., Michel, A. M. Illuminating translation with ribosome profiling spectra. Nat Methods. 13 (2), 123-124 (2016).
- Calviello, L., et al. Detecting actively translated open reading frames in ribosome profiling data. Nat Methods. 13 (2), 165-170 (2016).
- Michel, A. M., et al. RiboGalaxy: A browser based platform for the alignment, analysis and visualization of ribosome profiling data. RNA Biol. 13 (3), 316-319 (2016).
- Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet J. 17 (1), 10-12 (2011).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq–a Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinformatics. 31 (2), 166-169 (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- van den Elzen, A. M., Schuller, A., Green, R., Seraphin, B. Dom34-Hbs1 mediated dissociation of inactive 80S ribosomes promotes restart of translation after stress. EMBO J. 33 (3), 265-276 (2014).
- Guydosh, N. R., Green, R. Dom34 rescues ribosomes in 3′ untranslated regions. Cell. 156 (5), 950-962 (2014).
- Ingolia, N. T. Ribosome profiling: new views of translation, from single codons to genome scale. Nat Rev Genet. 15 (3), 205-213 (2014).
- Gerashchenko, M. V., Lobanov, A. V., Gladyshev, V. N. Genome-wide ribosome profiling reveals complex translational regulation in response to oxidative stress. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (43), 17394-17399 (2012).
- Weinberg, D. E., et al. Improved ribosome-footprint and mRNA measurements provide insights into dynamics and regulation of yeast translation. Cell Rep. 14 (7), 1787-1799 (2016).
- Park, J. E., Yi, H., Kim, Y., Chang, H., Kim, V. N. Regulation of poly(A) tail and translation during the somatic cell cycle. Mol Cell. 62 (3), 462-471 (2016).
- Howard, M. T., Carlson, B. A., Anderson, C. B., Hatfield, D. L. Translational redefinition of UGA codons is regulated by selenium availability. J Biol Chem. 288 (27), 19401-19413 (2013).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Ribonuclease selection for ribosome profiling. Nucleic Acids Res. 45 (2), e6 (2017).
- Gerashchenko, M. V., Gladyshev, V. N. Translation inhibitors cause abnormalities in ribosome profiling experiments. Nucleic Acids Res. 42 (17), e134 (2014).
- O’Connor, P. B., Andreev, D. E., Baranov, P. V. Comparative survey of the relative impact of mRNA features on local ribosome profiling read density. Nat Commun. 7, 12915 (2016).
