Protocolo experimental para detectar la función mitocondrial en hepatocitos expuestos a plaguicidas organoclorados

Los efectos de los plaguicidas organoclorados (OCP) en la salud, por ejemplo, interferencia reproductiva, toxicidad inmunológica, cambios metabólicos se han estudiado previamente^1,2,3. Los métodos para detectar el metabolismo celular y descubrir la disfunción mitocondrial han permitido a los científicos comprender el papel de la función mitocondrial(es decir., niveles de STAT3 mitocondrial, lactato, piruvato, relación lactato-piruvato, coenzima Q10, fuga de protones mitocondriales, bioenergética, biogénesis y dinámica) en áreas como el envejecimiento, la obesidad, la diabetes, la función cardiovascular, el cáncer y la toxicidad para la seguridad^4,,5,6,7. En este artículo, describimos los métodos para evaluar la disfunción mitocondrial causada por los OCP.

Hemos expuesto las células de HepG2 a un O-hexaclorociclohexano , un OCP representativo, durante 24 h a una dosis equivalente a la exposición interna de humanos. En primer lugar, se aplicó TEM para observar la ultraestructura de los hepatocitos, como núcleos, mitocondrias y retículo endoplasmático⁸. En comparación con los microscopios ordinarios, TEM permite explorar la ultraemetría 2D y 3D de células y componentes celulares (líneas celulares o tejidos), la morfología, composición química, así como la función de materiales naturales o artificiales que juegan un papel fundamental en la ciencia y la tecnología modernas. La función mitocondrial se evaluó aún más por la intensidad de fluorescencia mitocondrial, los niveles de adenosina 5′-trifosfato (ATP), la tasa de consumo de oxígeno (OCR) y el potencial de membrana mitocondrial (MMP) en células hepox2 incubadas con HCH. El verde mito-tracker es una sonda fluorescente verde de las mitocondrias que se puede utilizar para la tinción fluorescente específica de la célula viva. Las mitocondrias en los hepatocitos fueron manchadas por solución verde mito-tracker y se observó intensidad de fluorescencia mitocondrial, número y patrón con una microscopía confocal⁹. La sonda fluorescente verde mitocondrial se puede utilizar para manchar las células vivas. En comparación con la rhodamine 123 o JC-1, la sonda fluorescente verde mitocondrial no depende del potencial de membrana mitocondrial para la tinción mitocondrial. Los niveles de ATP fueron determinados por un kit de luciferasa-luciferina y normalizados por la concentración de proteínas. Kit de ensayo de ATP se puede utilizar para detectar los niveles de ATP en soluciones comunes, células o tejidos. Este kit se basa en la luciasa de lucilyzed por fluoresceína para generar fluorescencia, cuando se requiere ATP para proporcionar energía. Cuando la luciasa de la luciosa y la fluoresceína son excesivas, en un cierto rango de concentración, la generación de fluorescencia es proporcional a la concentración de ATP. Además, este kit ha sido especialmente diseñado para optimizar la quimiuminoscencia de ATP. ATP, como las moléculas de energía más importantes, juega un papel importante en los diversos procesos fisiológicos o patológicos de las células. Los cambios en los niveles de ATP pueden reflejar defectos en la función celular, especialmente la producción de energía mitocondrial. Generalmente bajo apoptosis, necrosis o en algún estado tóxico, los niveles celulares de ATP redujeron ^10. El kit de ensayo de MMP con JC-1 es un kit que utiliza JC-1 como sonda fluorescente para detectar células, tejidos o MMP purificados de forma rápida y sensible. Se puede utilizar para la detección temprana de apoptosis. El tinte catiónico JC-1 es una sonda fluorescente utilizada para detectar el MMP que se puede analizar bajo citometría de flujo indicada por cambios de relación de fluorescencia verde y roja. Cuando el MMP es alto, JC-1 se agrega en la matriz de las mitocondrias para formar un polímero (J-agregados), que produce fluorescencia roja. Cuando el MMP es bajo, JC-1 no se puede acumular, y forma monómero que produce fluorescencia verde¹¹. Así que la proporción de fluorescencia roja y verde puede reflejar el nivel de MMP. El OCR de las células es un indicador crucial de la función celular normal¹². Se considera como un parámetro para investigar la función mitocondrial. El kit de prueba de esfuerzo de mito celular proporciona un método estable para analizar los parámetros clave de la función mitocondrial. El kit proporciona control de calidad y reactivos predictivos, así como un método estándar para realizar pruebas de esfuerzo mitocondrial celular. Se puede utilizar para detectar todos los tipos de células, incluidas las células primarias, las líneas celulares, las células suspendidas, y también para los islotes, los nematodos, las levaduras y las mitocondrias aisladas.

La medición de OCR puede proporcionar información valiosa sobre el estado fisiológico o alteraciones de las células. Se determinó con un analizador de flujo extracelular para detectar la línea de base respiratoria, fuga de protones, respiratoria máxima, rotación de ATP y capacidad de reserva. En resumen, después de las mediciones basales de OCR, OCR se detectó después de agregar secuencialmente a la oligomicina (ACOPLAdor ATP), FCCP (desacoplador de fosforilación oxidativa mitocondrial) y antimicina A/ rotenona (un inhibidor del consumo de oxígeno) por pozo.

En un esfuerzo por facilitar el desarrollo de un protocolo más específico para la detección de la función mitocondrial en hepatocitos in vitro, presentamos aquí experimentos por TEM, microscopía confocal, luminómetro, citometría de flujo y analizador de flujo extracelular con aplicación futura en el estudio de los resultados adversos relacionados con el daño de las mitocondrias.