Protocollo sperimentale per il rilevamento della funzione mitocondriale negli eparitociti esposti ai pesticidi organoclorina

Gli effetti dei pesticidi organoclori (OC) sulla salute, ad esempio l’interferenza riproduttiva, la tossicità immunologica, i cambiamenti metabolici sono stati precedentemente^{studiati 1,2,3}. I metodi per rilevare il metabolismo cellulare e scoprire la disfunzione mitocondriale hanno permesso agli scienziati di comprendere il ruolo della funzionemitocondriale (cioè., livelli di STAT3 mitocondriale, lattato, piruvato, rapporto lattato-piruvate, coenzime Q10, perdita di protono mitocondriale, bioenergetica, biogenesi e dinamica) in aree come l’invecchiamento, l’obesità, il diabete, la funzione cardiovascolare, il cancro e la tossicità di sicurezza^4,5,6,7. In questo articolo, descriviamo i metodi per valutare la disfunzione mitocondriale causata da OCP.

Abbiamo esposto le cellule DiPG2 a β-esachlorocyclohexane (β-HCH), un OCP rappresentativo, per 24 h ad una dose equivalente all’esposizione interna dell’uomo. In primo luogo, TEM è stato applicato per osservare l’ultrastruttura degli epariti, come nuclei, mitocondri e endoplasmice reticulum⁸. Rispetto ai normali microscopi, TEM consente di esplorare l’ultrastruttura 2D e 3D di cellule e componenti cellulari (linee cellulari o tessuti), la morfologia, la composizione chimica, nonché la funzione di materiali naturali o artificiali che svolgono un ruolo fondamentale nella scienza e nella tecnologia moderne. La funzione mitocondriale è stata ulteriormente valutata dall’intensità della fluorescenza mitocondriale, dai livelli di adenosina 5′-triphosphate (ATP), dal tasso di consumo di ossigeno (OCR) e dal potenziale di membrana mitocondriale (MMP)nelle cellule HepG2 incubate con β-HCH. Mito-tracker green è una sonda fluorescente verde mitocondri che può essere utilizzata per la colorazione fluorescente specifica mitocondriale a cellule vive. I mitocondri negli eparociti sono stati macchiati da soluzione verde mito-tracker e intensità di fluorescenza mitocondriale, numero e modello sono stati osservati con una microscopia confocale⁹. La sonda fluorescente verde mitocondriale può essere utilizzata per macchiare le cellule vive. Rispetto alla rodamina 123 o JC-1, la sonda fluorescente verde mitocondriale non dipende dal potenziale di membrana mitocondriale per la colorazione mitocondriale. I livelli di ATP sono stati determinati da un kit luciferasi-luciferina e normalizzati dalla concentrazione di proteine. Kit di analisi ATP può essere utilizzato per rilevare i livelli di ATP in soluzioni comuni, cellule o tessuti. Questo kit si basa sulla luciferasi luccilice catalizzato dalla fluoresina per generare fluorescenza, quando l’ATP è necessario per fornire energia. Quando la luccilice luciferasi e la fluoresina sono eccessive, in un certo intervallo di concentrazione, la generazione di fluorescenza è proporzionale alla concentrazione di ATP. Inoltre, questo kit è stato appositamente progettato per ottimizzare la chemiluminescenza di ATP. L’ATP, come le molecole energetiche più importanti, svolge un ruolo importante nei vari processi fisiologici o patologici delle cellule. I cambiamenti nei livelli ATP possono riflettere i difetti nella funzione cellulare, in particolare la produzione di energia mitocondriale. Di solito sotto apoptosi, necrosi o in qualche stato tossico, i livelli di ATP cellulare ridotto ¹⁰. Il kit di analisi MMPs con JC-1 è un kit che utilizza JC-1 come sonda fluorescente per rilevare cellule, tessuti o MMP purificati in modo rapido e sensibile. Può essere utilizzato per la diagnosi precoce di apoptosi. Il colorante cationico JC-1 è una sonda fluorescente utilizzata per rilevare l’MMP che può essere analizzata sotto la citometria di flusso indicata dai cambiamenti del rapporto di fluorescenza verde e rossa. Quando l’MMP è alto, JC-1 viene aggregato nella matrice dei mitocondri per formare un polimero (J-aggregati), che produce fluorescenza rossa. Quando l’MMP è basso, JC-1 non può accumularsi e forma monomero che produce fluorescenza verde¹¹. Quindi il rapporto tra fluorescenza rossa e verde può riflettere il livello di MMP. L’OCR delle cellule è un indicatore cruciale della normale funzione cellulare¹². È considerato come un parametro per la ricerca della funzione mitocondriale. Cell mito stress test kit fornisce un metodo stabile per l’analisi dei parametri chiave della funzione mitocondriale. Il kit fornisce il controllo di qualità e reagenti predittivi, nonché un metodo standard per l’esecuzione di test di stress mitocondriale cellulare. Può essere utilizzato per rilevare tutti i tipi di cellule, comprese le cellule primarie, linee cellulari, cellule sospese, e anche per isolotti, nematodi, lieviti e mitocondri isolati.

La misurazione OCR può fornire preziose informazioni sullo stato fisiologico o sulle alterazioni delle cellule. È stato determinato con un analizzatore di flusso extracellulare per rilevare la linea di base respiratoria, la perdita di protoni, il massimo respiratorio, il turnover ATP e la capacità di riserva. In breve, dopo le misurazioni di base di OCR, OCR è stato rilevato dopo l’aggiunta sequenziale a oligomicina (ATP Coupler), FCCP (fosforilazione ossidativa mitocondriale) per pozzo.

Nel tentativo di facilitare lo sviluppo di un protocollo più specifico per rilevare la funzione mitocondriale negli eparociti in vitro, presentiamo qui esperimenti di TEM, microscopia confocale, luminometro, citometria di flusso e analizzatore di flusso extracellulare con futura applicazione nello studio dei danni ai mitocondri relativi agli esiti avversi.