פרוטוקול ניסיוני לזיהוי תפקוד מיטוכונדריאלי בהפטוציטים שנחשפו לחומרי הדברה אורגנוכלורין
Summary
הבנת ההשפעה של חומרי הדברה אורגנוכלורין סביבתיים (OCPs) על תפקוד המיטוכונדריאלי בהפטוציטים חשוב לחקור את המנגנון של OCPs גורם להפרעות מטבוליות. נייר זה מציג שיטות מפורטות על זיהוי פונקציית המיטוכונדריה הכבד.
Abstract
נייר זה מציג שיטות מפורטות על זיהוי תפקוד המיטוכונדריאלי הכבד להבנה טובה יותר של הגורם להפרעות מטבוליות הנגרמות על ידי חומרי הדברה אורגנוכלורין סביבתיים (OCPs) בהפטוציטים. תאי HepG2 נחשפו β-hexachlorocyclohexane (β-HCH) במשך 24 שעות במינון שווה ערך של חשיפה פנימית באוכלוסייה הכללית. Ultrastructure בהפטוציטים נבדק על ידי מיקרוסקופאלקטרונים שידור (TEM) כדי להראות את הנזק של המיטוכונדריה. תפקוד המיטוכונדריה הוערך עוד יותר על ידי עוצמת פלואורסצנטי מיטוכונדריאלי, אדנוסין 5′-טריפוספט (ATP) רמות, קצב צריכת חמצן (OCR) ופוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (MMP) בתאי HepG2 דגירה עם β-HCH. עוצמת המיטוכונדריה פלואורסצנטית לאחר מוכתם על ידי בדיקה פלואורסצנטי ירוק מיטוכונדריאלי נצפתה עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי. תגובת לוציפרין-לוציפראז שימשה לקביעת רמות ATP. MMP זוהה על ידי צבע cationic JC-1 וניתח תחת ציתימת זרימה. OCR נמדד עם מנתח שטף extracellular. לסיכום, פרוטוקולים אלה שימשו לזיהוי פונקציה מיטוכונדריאלית בהפטוציטים עם לחקור נזקי המיטוכונדריה.
Introduction
ההשפעות של חומרי הדברה אורגנוכלורין (OCPs) על בריאות, למשל התערבות הרבייה, רעילות חיסונית, שינויים מטבולייםנחקרו בעבר 1,,2,3. השיטות לזיהוי חילוף חומרים תאי ולגלות תפקוד מיטוכונדריאלי אפשרו למדענים להבין את התפקיד של תפקוד המיטוכונדריה (כלומר.רמות STAT3 מיטוכונדריאלי, לקטאט, pyruvate, יחס לקטר-pyruvate, קואנזים Q10, דליפת פרוטון מיטוכונדריאלי, bioenergetics, biogenesis, ודינמיקה) בתחומים כגון הזדקנות, השמנת יתר, סוכרת, תפקוד לב וכלי דם,סרטן, רעילותבטיחות 4,5,6,7. בעיתון זה, אנו מתארים את השיטות על הערכת תפקוד מיטוכונדריאלי שנגרם על ידי OCPs.
חשפנו תאי HepG2 β-hexachlorocyclohexane (β-HCH), OCPs נציג אחד, במשך 24 שעות במינון שווה ערך לחשיפה פנימית של אדם. ראשית, TEM הוחל כדי לצפות במבנה האולטרה של hepatocytes, כגון גרעין, מיטוכונדריה ו אנדופלסמי רטיטולום8. בהשוואה למיקרוסקופים רגילים, TEM מאפשר לחקור את מבנה האולטרה-תלת-מידי והתלת-מיויד של תאים ורכיבי תאים (קווי תאים או רקמה), מורפולוגיה, הרכב כימי, כמו גם פונקציה של חומרים טבעיים או מלאכותיים המגללים תפקיד מרכזי במדע ובטכנולוגיה המודרניים. תפקוד המיטוכונדריה הוערך עוד יותר על ידי עוצמת פלואורסצנטי מיטוכונדריאלי, אדנוסין 5′-טריפוספט (ATP) רמות, קצב צריכת חמצן (OCR) ופוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי (MMP)בתאי HepG2 דגירה עם β-HCH. ירוק מיטו-גשש הוא בדיקה פלורסנט ירוק המיטוכונדריה שיכול לשמש כתמי פלואורסצנט מיטוכונדריאלי ספציפי תא חי. המיטוכונדריה בהפטוציטים הוכתמה על ידי תמיסה ירוקה מיטו-גשש ועוצמת פלואורסצסצנציה מיטוכונדריאלית, מספר ודפוס נצפו עם מיקרוסקופ confocal9. בדיקה מיטוכונדריאלית ירוקה פלורסנט יכול לשמש כדי להכתים תאים חיים. בהשוואה לרודמין 123 או JC-1, בדיקה פלואורסצנטית ירוקה מיטוכונדריאלית אינה תלויה בפוטנציאל קרום מיטוכונדריאלי לכתמים מיטוכונדריאליים. רמות ATP נקבעו על ידי ערכת לוציפראז-לוציפרין ומנורמל על ידי ריכוז חלבון. ערכת אחסון ATP יכול לשמש כדי לזהות רמות ATP בפתרונות נפוצים, תאים או רקמות. ערכה זו מבוססת על גחלילית לוציפראז נבליזה על ידי פלואורסצן כדי ליצור פלואורסצנט, כאשר ATP נדרש לספק אנרגיה. כאשר לוציפראז גחלילית ופלואורסצ’ין הם מוגזמים, בטווח ריכוז מסוים, דור הפלואורסצנט הוא פרופורציונלי לריכוז של ATP. בנוסף, ערכה זו תוכננה במיוחד כדי לייעל את הכימותרפיה של ATP. ATP, כמו מולקולות האנרגיה החשובות ביותר, ממלא תפקיד חשוב בתהליכים פיזיולוגיים או פתולוגיים שונים של תאים. שינויים ברמות ATP יכול לשקף פגמים בתפקוד התא, במיוחד ייצור אנרגיה מיטוכונדריאלית. בדרך כלל תחת אפופטוזיס, נמק או במצב רעיל כלשהו, רמות ATP הסלולר מופחת 10. ערכת אסאי MMPs עם JC-1 היא ערכה המשתמשת JC-1 כבדיקה פלורסנט כדי לזהות תאים, רקמות או MMPs מטוהר במהירות וברגישות. זה יכול לשמש לגילוי מוקדם של אפופטוזיס. הצבע cationic JC-1 הוא גשושית פלורסנט המשמשת לזיהוי MMP אשר ניתן לנתח תחת ציתימת זרימה המצוינת על ידי שינויים של יחס פלואורסצנטי ירוק ואדום. כאשר ה-MMP גבוה, JC-1 נצבר במטריצה של המיטוכונדריה כדי ליצור פולימר (אגרגטים J), המייצר פלואורסצנס אדום. כאשר MMP נמוך, JC-1 אינו יכול לצבור, ויוצר מונומר המייצר פלואורסצנס ירוק11. אז היחס של פלואורסץ אדום וירוק יכול לשקף את הרמה של MMP. OCR של תאים הוא אינדיקטור מכריע של תפקוד תאי נורמלי12. הוא נחשב כפרמטר למחקר פונקציה מיטוכונדריאלית. ערכת בדיקת מיטו של התא מספקת שיטה יציבה לניתוח פרמטרים מרכזיים של פונקציית מיטוכונדריאלי. הערכה מספקת בקרת איכות ריגנטים חזוי, כמו גם שיטה סטנדרטית לביצוע בדיקת מיטוכונדריה של תאים. זה יכול לשמש כדי לזהות את כל סוגי התאים, כולל תאים ראשיים, קווי תאים, תאים מושעים, וגם עבור איונים, נמטודות, שמרים ומיטוכונדריה מבודדת.
מדידת OCR יכולה לספק תובנה חשובה לגבי המצב הפיזיולוגי או שינויים של תאים. זה נקבע עם מנתח שטף תות-תאי כדי לזהות בסיס נשימה, דליפת פרוטון, נשימה מקסימלית, מחזור ATP וקיבולת מילואים. בקצרה, לאחר מדידות בסיסיות של OCR, OCR זוהה לאחר הוספה רציפה אוליגומיצין (ATP מינר), FCCP (מיטוכונדריאלי חמצון phosphorylation uncoupler) ואנטימיצין A / rotenone (מעכב של צריכת חמצן)לכל טוב.
במאמץ להקל על הפיתוח של פרוטוקול ספציפי יותר לזיהוי פונקציה מיטוכונדריאלית בהפטוציטים במבחנה, אנו מציגים כאן ניסויים על ידי TEM, מיקרוסקופיה קונפוקלית, luminometer, ציטומטריה זרימה ומנתח שטף חוץ-תאי עם יישום עתידי בחקר תוצאות שליליות הקשורות נזק המיטוכונדריה.
Protocol
Representative Results
Discussion
קריטי להצלחת פרוטוקול הזיהוי הוא השימוש במגוון שיטות ניסיוניות כיסו את המחקר מפנוטיפ למנגנון. במחקר זה, תאי HepG2 היו תרבותיים DMEM עם פניצילין וסטרפטומיצין ו 10% סרום של פר העובר. כאשר תאים הגיעו 40-50% confluence, β-HCH (0, 10, 100 ng/mL) נוספו ותווספו במשך 24 שעות. השתמשנו לראשונה TEM אשר הראה את השינויים ultrastructural…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (גרנט מס’ 81573174, 81570574); קרן הנוער המצטיינים של מחוז ג’יאנגסו (SBK2014010296); פרויקט המחקר של משרד החינוך הסיני (213015A); פיתוח התוכנית האקדמית עדיפות של מוסדות להשכלה גבוהה ג’יאנגסו (PAPD), פיתוח מרכזי הדגל של מוסדות להשכלה גבוהה ג’יאנגסו; ותכנית הפרויקט הפתוח של המעבדה לכימיה סביבתית ואקוטוקסיקולוגיה (KF2015-01).
Materials
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
References
- Rantakokko, P., et al. Persistent organic pollutants and non-alcoholic fatty liver disease in morbidly obese patients: a cohort study. Environ Health. 14, 79 (2015).
- Mrema, E. J., et al. Persistent organochlorinated pesticides and mechanisms of their toxicity. Toxicology. 307, 74-88 (2013).
- Dirinck, E., et al. Obesity and persistent organic pollutants: possible obesogenic effect of organochlorine pesticides and polychlorinated biphenyls. Obesity (Silver Spring). 19 (4), 709-714 (2011).
- Genini, D., et al. Mitochondrial dysfunction induced by a SH2 domain-targeting STAT3 inhibitor leads to metabolic synthetic lethality in cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).
- Korovljev, D., Trivic, T., Drid, P., Ostojic, S. M. Molecular hydrogen affects body composition, metabolic profiles, and mitochondrial function in middle-aged overweight women. Ir J Med Sci. , (2017).
- Gonzalez-Franquesa, A., Patti, M. E. Insulin Resistance and Mitochondrial Dysfunction. Adv Exp Med Biol. 982, 465-520 (2017).
- Cheng, J., et al. Mitochondrial Proton Leak Plays a Critical Role in Pathogenesis of Cardiovascular Diseases. Adv Exp Med Biol. 982, 359-370 (2017).
- Cheville, N. F., Stasko, J. Techniques in electron microscopy of animal tissue. Vet Pathol. 51 (1), 28-41 (2014).
- Nazmara, Z., Salehnia, M., HosseinKhani, S. Mitochondrial Distribution and ATP Content of Vitrified, In vitro Matured Mouse Oocytes. Avicenna J Med Biotechnol. 6 (4), 210-217 (2014).
- Clapier, C. R., Iwasa, J., Cairns, B. R., Peterson, C. L. Mechanisms of action and regulation of ATP-dependent chromatin-remodelling complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. , (2017).
- Reitman, Z. J., et al. Cancer-associated isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) R132H mutation and d-2-hydroxyglutarate stimulate glutamine metabolism under hypoxia. J Biol Chem. 289 (34), 23318-23328 (2014).
- Nelson, J. A. Oxygen consumption rate v. rate of energy utilization of fishes: a comparison and brief history of the two measurements. J Fish Biol. 88 (1), 10-25 (2016).
- Liu, Q., et al. Organochloride pesticides impaired mitochondrial function in hepatocytes and aggravated disorders of fatty acid metabolism. Sci Rep. 7, 46339 (2017).
- Tien, T., et al. High Glucose Induces Mitochondrial Dysfunction in Retinal Muller Cells: Implications for Diabetic Retinopathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 58 (7), 2915-2921 (2017).
- Dussmann, H., Perez-Alvarez, S., Anilkumar, U., Papkovsky, D. B., Prehn, J. H. Single-cell time-lapse imaging of intracellular O2 in response to metabolic inhibition and mitochondrial cytochrome-c release. Cell Death Dis. 8 (6), 2853 (2017).
- Jaiswal, M. K. Riluzole But Not Melatonin Ameliorates Acute Motor Neuron Degeneration and Moderately Inhibits SOD1-Mediated Excitotoxicity Induced Disrupted Mitochondrial Ca2+ Signaling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Front Cell Neurosci. 10, 295 (2016).
- Song, E., et al. Lenti-siRNA Hsp60 promote bax in mitochondria and induces apoptosis during heat stress. Biochem Biophys Res Commun. 481 (1-2), 125-131 (2016).
- Li, Y., et al. Tea tree oil exhibits antifungal activity against Botrytis cinerea by affecting mitochondria. Food Chem. 234, 62-67 (2017).
- Grunig, D., Felser, A., Bouitbir, J., Krahenbuhl, S. The catechol-O-methyltransferase inhibitors tolcapone and entacapone uncouple and inhibit the mitochondrial respiratory chain in HepaRG cells. Toxicol In Vitro. 42, 337-347 (2017).
- Mayor, F., et al. G protein-coupled receptor kinase 2 (GRK2) as an integrative signalling node in the regulation of cardiovascular function and metabolic homeostasis. Cell Signal. , (2017).
- Clark, A., Mach, N. The Crosstalk between the Gut Microbiota and Mitochondria during Exercise. Front Physiol. 8, 319 (2017).
- Robicsek, O., et al. Isolated Mitochondria Transfer Improves Neuronal Differentiation of Schizophrenia-Derived Induced Pluripotent Stem Cells and Rescues Deficits in a Rat Model of the Disorder. Schizophr Bull. , (2017).
- Akinrotimi, O., et al. Shp deletion prevents hepatic steatosis and when combined with Fxr loss protects against type 2 diabetes. Hepatology. , (2017).
- Rosa, A. I., et al. Novel insights into the antioxidant role of tauroursodeoxycholic acid in experimental models of Parkinson’s disease. Biochim Biophys Acta. , (2017).
- Matondo, A., Kim, S. S. Targeted-Mitochondria Antioxidants Therapeutic Implications in Inflammatory Bowel Disease. J Drug Target. , 1-30 (2017).
