Experimentelles Protokoll zum Nachweis der mitochondrialen Funktion in Hepatozyten, die Organochlor-Pestiziden ausgesetzt sind
Summary
Das Verständnis des Einflusses von Umweltorganochlor-Pestiziden (OCPs) auf die mitochondriale Funktion in Hepatozyten ist wichtig bei der Erforschung des Mechanismus von OCPs, die Stoffwechselstörungen verursachen. In diesem Beitrag werden detaillierte Methoden zum Nachweis der hepatischen mitochondrialen Funktion beschrieben.
Abstract
Dieses Papier stellt detaillierte Methoden zum Nachweis der hepatischen mitochondrialen Funktion vor, um die Ursache von Stoffwechselstörungen, die durch Organischechlorpestizide (OCPs) in Hepatozyten verursacht werden, besser zu verstehen. HepG2-Zellen wurden 24 h lang bei einer äquivalenten Dosis interner Exposition in der allgemeinen Population einem Hexachlorcyclohexan (-HCH) ausgesetzt. Die Ultrastruktur in Hepatozyten wurde durch Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) untersucht, um die Schäden von Mitochondrien aufzuzeigen. Die mitochondriale Funktion wurde weiter durch die mitochondriale Fluoreszenzintensität, adenosin5′-Triphosphat (ATP)-Spiegel, die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und das mitochondriale Membranpotential (MMP) in HepG2-Zellen, die mit dem Wert von -HCH inkubiert wurden, untersucht. Die Mitochondrienfluoreszenzintensität nach der Färbung durch mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde wurde mit einer Fluoreszenzmikroskopie beobachtet. Die Luziferin-Luziferase-Reaktion wurde verwendet, um ATP-Spiegel zu bestimmen. Das MMP wurde vom kationischen Farbstoff JC-1 nachgewiesen und unter Strömungszytometrie analysiert. OCR wurde mit einem extrazellulären Flussanalysator gemessen. Zusammenfassend wurden diese Protokolle verwendet, um mitochondriale Funktion in Hepatozyten mit zur Untersuchung von Mitochondrienschäden zu untersuchen.
Introduction
Die Auswirkungen von Organochlor-Pestiziden (OCPs) auf die Gesundheit, z. B. reproduktive Interferenzen, immunologische Toxizität, metabolische Veränderungen wurden zuvor untersucht1,2,3. Die Methoden, um zellulären Stoffwechsel zu erkennen und herauszufinden, mitochondriale Dysfunktion haben Wissenschaftler in die Lage, die Rolle der mitochondrialen Funktion zu verstehen(d.h., mitochondriale STAT3-Spiegel, Laktat, Pyruvat, Laktat-Zu-Pyruvat-Verhältnis, Coenzym Q10, mitochondriales Protonenleck, Bioenergetik, Biogenese und Dynamik) in Bereichen wie Alterung, Fettleibigkeit, Diabetes, Herz-Kreislauf-Funktion, Krebs und Sicherheitstoxizität4,5,6,7. In diesem Beitrag beschreiben wir die Methoden zur Bewertung der durch OCPs verursachten mitochondrialen Dysfunktion.
Wir setzten HepG2-Zellen 24 h in einer Dosis, die der inneren Exposition des Menschen entspricht, einem repräsentativen OCPs (Hexachlorcyclohexan) aus. Erstens wurde TEM angewendet, um die Ultrastruktur von Hepatozyten wie Kernen, Mitochondrien und endoplasmatischem Retikulum8zu beobachten. Im Vergleich zu gewöhnlichen Mikroskopen ermöglicht TEM die Untersuchung der 2D- und 3D-Ultrastruktur von Zellen und Zellkomponenten (Zelllinien oder Gewebe), der Morphologie, der chemischen Zusammensetzung sowie der Funktion natürlicher oder künstlicher Materialien, die in der modernen Wissenschaft und Technologie eine zentrale Rolle spielen. Die mitochondriale Funktion wurde weiter durch die mitochondriale Fluoreszenzintensität, adenosin5′-Triphosphat (ATP)-Spiegel, die Sauerstoffverbrauchsrate (OCR) und das mitochondriale Membranpotential (MMP) in HepG2-Zellen, die mit dem Wert von -HCH inkubiert wurden, untersucht. Mito-tracker grün ist eine mitochondriengrüne Fluoreszenzsonde, die für lebende Zellmitochondrial-spezifische fluoreszierende Färbung verwendet werden kann. Die Mitochondrien in Hepatozyten wurden durch mito-tracker grüne Lösung und mitochondriale Fluoreszenzintensität, Anzahl und Muster wurden mit einer konfokalen Mikroskopie9beobachtet. Mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde kann verwendet werden, um lebende Zellen zu färben. Im Vergleich zu Rhodamin 123 oder JC-1 hängt die mitochondriale grüne Fluoreszenzsonde nicht vom mitochondrialen Membranpotenzial für mitochondriale Färbung ab. ATP-Spiegel wurden durch ein Luziferase-Luziferin-Kit bestimmt und durch Proteinkonzentration normalisiert. ATP Assay Kit kann verwendet werden, um ATP-Spiegel in gängigen Lösungen, Zellen oder Geweben zu erkennen. Dieses Kit basiert auf Glögfliegen-Luziferase, die durch Fluorescein katalysiert werden, um Fluoreszenz zu erzeugen, wenn ATP zur Energiebereitstellung benötigt wird. Wenn die Galleife und Fluorescein in einem bestimmten Konzentrationsbereich exzessiv sind, ist die Erzeugung von Fluoreszenz proportional zur ATP-Konzentration. Darüber hinaus wurde dieses Kit speziell entwickelt, um die Chemilumineszenz von ATP zu optimieren. ATP als wichtigste Energiemoleküle spielt eine wichtige Rolle in den verschiedenen physiologischen oder pathologischen Prozessen der Zellen. Veränderungen der ATP-Spiegel können Defekte in der Zellfunktion widerspiegeln, insbesondere die mitochondriale Energieerzeugung. In der Regel unter Apoptose, Nekrose oder in einem toxischen Zustand, zelluläre ATP-Spiegel reduziert 10. MMPs Assay Kit mit JC-1 ist ein Kit, das JC-1 als Fluoreszenzsonde verwendet, um Zellen, Gewebe oder gereinigte MMPs schnell und empfindlich zu erkennen. Es kann zur Früherkennung von Apoptose verwendet werden. Der kationische Farbstoff JC-1 ist eine fluoreszierende Sonde, die verwendet wird, um das MMP zu detektieren, das unter Durchflusszytometrie analysiert werden kann, die durch Veränderungen des grünen und roten Fluoreszenzverhältnisses angezeigt wird. Wenn das MMP hoch ist, wird JC-1 in der Matrix der Mitochondrien zu einem Polymer (J-Aggregate) aggregiert, das rote Fluoreszenz erzeugt. Wenn das MMP niedrig ist, kann JC-1 nicht akkumulieren und bildet Monomer, das grüne Fluoreszenz11erzeugt. Das Verhältnis von roter und grüner Fluoreszenz kann also das MMP-Niveau widerspiegeln. Die OCR von Zellen ist ein entscheidender Indikator für die normale zelluläre Funktion12. Es gilt als Parameter für die Forschung mitochondriale Funktion. Das Cell Mito Stress Test Kit bietet eine stabile Methode zur Analyse wichtiger Parameter der mitochondrialen Funktion. Das Kit bietet Qualitätskontrolle und prädiktive Reagenzien sowie eine Standardmethode für die Durchführung von Zellmitochondrialen Stresstests. Es kann verwendet werden, um alle Zelltypen zu erkennen, einschließlich Primärzellen, Zelllinien, suspendierte Zellen, und auch für Inselchen, Nematoden, Hefen und isolierte Mitochondrien.
OCR-Messungen können wertvolle Einblicke in den physiologischen Zustand oder Veränderungen von Zellen geben. Es wurde mit einem extrazellulären Flussanalysator bestimmt, um Atembasislinie, Protonenleck, maximale Atemwege, ATP-Umsatz und Reservekapazität zu erkennen. Kurz gesagt, nach Basismessungen von OCR, OCR wurde nach sequenzieller Zugabe zu Oligomycin (ATP Coupler), FCCP (mitochondrialoxide oxidative Phosphorylierung Entkoppler) und Antimycin A/Roton (ein Inhibitor des Sauerstoffverbrauchs) pro Brunnen nachgewiesen.
In dem Bestreben, die Entwicklung eines spezifischeren Protokolls zum Nachweis der mitochondrialen Funktion in Hepatozyten in vitro zu erleichtern, präsentieren wir hier Experimente von TEM, konfokale Mikroskopie, Luminometer, Durchflusszytometrie und extrazelluläre Flussanalysatoren mit zukünftiger Anwendung bei der Untersuchung von Mitochondrien, die mit negativen Ergebnissen zusammenhängen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Entscheidend für den Erfolg des Nachweisprotokolls ist die Verwendung einer Vielzahl experimenteller Methoden, die in der Studie vom Phänotyp bis zum Mechanismus behandelt wurden. In dieser Studie wurden HepG2-Zellen in DMEM mit Penicillin und Streptomycin und 10% fetalem Rinderserum kultiviert. Wenn die Zellen 40-50% Zusammenfluss erreichten, wurden die Zellen (0, 10, 100 ng/mL) zugesetzt und für 24 h inkubiert. Wir verwendeten zunächst TEM, das die ultrastrukturellen Veränderungen in Hepatozyten zeigte, die durch …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China unterstützt (Grant-Nr. 81573174, 81570574); den Herausragenden Jugendfonds der Provinz Jiangsu (SBK2014010296); das Forschungsprojekt des chinesischen Bildungsministeriums (213015A); die vorrangige Entwicklung des Akademischen Programms der Jiangsu-Hochschuleinrichtungen (PAPD), der wichtigsten Entwicklung der Jiangsu-Hochschuleinrichtungen; und das Open Project Program des State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology (KF2015-01).
Materials
| Transmission electron microscope | FEI | Tecnai G2 Spirit Bio TWIN | High-contrast, high-resolution imaging, Low-dose observation and imaging, Low-temperature observation, Outstanding analytical performance, Automation for convenience and performance |
| Mito-Tracker Green | Beyotime | C1048 | Mito-Tracker Green is a mitochondrial green fluorescent probe that can be used for live cell mitochondrial-specific fluorescent staining. |
| Laser scanning confocal microscope | Zeiss | 700B | The design is compact, stable, light path is the shortest, high light precision, creative technology and sophisticated scanning technology together to produce a perfect 3-dimensional specimen image. |
| Enhanced ATP Assay Kit | Beyotime | S0027 | Enhanced ATP Assay Kit can be used to detect ATP (adenosine 5'-triphosphate) levels in common solutions, cells or tissues. Cells and tissue samples can be split to complete the sample preparation, detection sensitivity up to 0.1nmol / L, chemiluminescence can be sustained for 30 minutes. |
| Luminometer | Berthold | Centro LB 960 | Luminometer is chemiluminescence detector, the test sample itself can be light, do not need to stimulate. Luminometer is the instrument that detects chemiluminescence. |
| BCA Protein Assay Kit | Beyotime | P0012 | BCA Protein Assay Kit is one of the most commonly used methods for detecting protein concentrations. |
| Multimode reader | TECAN | InfiniteM200 | Multimode reader be used to detect protein consentration. |
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