Protocole expérimental pour la détection de la fonction mitochondriale chez les hépatocytes exposés aux pesticides organochlorés

Les effets des pesticides organochlorés (PCO) sur la santé, par exemple l’interférence reproductrice, la toxicité immunologique, les changements métaboliques ont été précédemment étudiés^1,2,3. Les méthodes pour détecter le métabolisme cellulaire et découvrir le dysfonctionnement mitochondrial ont permis aux scientifiques de comprendre le rôle de la fonction mitochondriale(c.-à-d., niveaux de STAT3 mitochondrial, lactate, pyruvate, rapport lactate-pyruvate, coenzyme Q10, fuite de protons mitochondrials, bioénergétique, biogenèse, et dynamique) dans des domaines tels que le vieillissement, l’obésité, le diabète, la fonction cardiovasculaire, le cancer, et la toxicité de sécurité^4,5,6,7. Dans cet article, nous décrivons les méthodes sur l’évaluation du dysfonctionnement mitochondrial provoqué par les OCP.

Nous avons exposé les cellules hepG2 à β-hexachlorocyclohexane (β-HCH), un OCP représentatif, pendant 24 h à une dose équivalente à l’exposition interne de l’homme. Tout d’abord, TEM a été appliqué pour observer l’ultrastructure des hépatocytes, tels que les noyaux, les mitochondries et le réticulum endoplasmique⁸. Par rapport aux microscopes ordinaires, TEM permet d’explorer l’ultra-structure 2D et 3D des cellules et des composants cellulaires (lignées cellulaires ou tissu), la morphologie, la composition chimique, ainsi que la fonction des matériaux naturels ou artificiels qui jouent un rôle central dans la science et la technologie modernes. La fonction mitochondriale a été évaluée par l’intensité de fluorescence mitochondriale, les niveaux d’adénosine 5′-triphosphate (ATP), le taux de consommation d’oxygène (OCR) et le potentiel memitorial de membrane (MMP)dans les cellules d’HepG2 incubées avec β-HCH. Mito-tracker vert est une sonde fluorescente verte mitochondries qui peut être utilisée pour la coloration fluorescente spécifique aux cellules vivantes. Les mitochondries dans les hépatocytes ont été tachées par la solution verte de mito-tracker et l’intensité de fluorescence mitochondriale, le nombre et le modèle ont été observés avec une microscopie confocale⁹. La sonde fluorescente verte mitochondriale peut être employée pour tacher des cellules vivantes. Par rapport à la rhodamine 123 ou à JC-1, la sonde fluorescente vert mitochondrial ne dépend pas du potentiel de membrane mitochondriale pour la coloration mitochondriale. Les niveaux d’ATP ont été déterminés par un kit de luciferase-luciferin et normalisés par la concentration de protéine. Le kit d’essai ATP peut être utilisé pour détecter les niveaux d’ATP dans les solutions, cellules ou tissus courants. Ce kit est basé sur luciferase de luciferase de lucfly catalysé par la fluorescéine pour produire la fluorescence, quand l’ATP est nécessaire pour fournir l’énergie. Lorsque la luciferase et la fluorescéine de lucfly sont excessives, dans une certaine plage de concentration, la génération de fluorescence est proportionnelle à la concentration d’ATP. En outre, ce kit a été spécialement conçu pour optimiser la chemiluminescence de l’ATP. L’ATP, en tant que molécules énergétiques les plus importantes, joue un rôle important dans les différents processus physiologiques ou pathologiques des cellules. Les changements dans les niveaux d’ATP peuvent refléter des défauts dans la fonction cellulaire, particulièrement la production d’énergie mitochondriale. Habituellement sous apoptose, nécrose ou dans un état toxique, les niveaux d’ATP cellulaire réduit ¹⁰. Le kit d’analyse MMP avec JC-1 est un kit qui utilise JC-1 comme sonde fluorescente pour détecter les cellules, les tissus ou les MMP purifiés rapidement et avec sensibilité. Il peut être utilisé pour la détection précoce de l’apoptose. Le colorant cationique JC-1 est une sonde fluorescente utilisée pour détecter le MMP qui peut être analysée sous cytométrie de débit indiquée par des changements de rapport de fluorescence vert et rouge. Lorsque le MMP est élevé, le JC-1 est agrégé dans la matrice des mitochondries pour former un polymère (agrégats J), qui produit de la fluorescence rouge. Lorsque le MMP est faible, JC-1 ne peut pas s’accumuler, et forme monomère qui produit la fluorescence verte¹¹. Ainsi, le rapport de fluorescence rouge et vert peut refléter le niveau de MMP. L’OCR des cellules est un indicateur crucial de la fonction cellulaire normale¹². Il est considéré comme un paramètre pour la recherche de la fonction mitochondriale. Cell mito stress test kit fournit une méthode stable pour analyser les paramètres clés de la fonction mitochondriale. Le kit fournit le contrôle de la qualité et les réactifs prédictifs ainsi qu’une méthode standard pour effectuer le test de stress mitochondrial cellulaire. Il peut être utilisé pour détecter tous les types de cellules, y compris les cellules primaires, les lignées cellulaires, les cellules en suspension, et aussi pour les îlots, les nématodes, les levures et les mitochondries isolées.

La mesure de l’OCR peut fournir un aperçu précieux de l’état physiologique ou des altérations des cellules. Il a été déterminé avec un analyseur de flux extracellulaire pour détecter la ligne de base de respiration, la fuite de proton, la respiration maximale, le chiffre d’affaires d’ATP et la capacité de réserve. En bref, après des mesures de base de l’OCR, l’OCR a été détecté après avoir ajouté séquentiellement à l’oligomycine (ATP Coupler), FCCP (phosphorylation oxydative mitochondriale uncoupler) et antimycine A/roténone (un inhibiteur de la consommation d’oxygène) par puits.

Dans un effort pour faciliter le développement d’un protocole plus spécifique pour détecter la fonction mitochondriale chez les hépatocytes in vitro, nous présentons ici des expériences par TEM, microscopie confocale, luminomètre, cytométrie de flux et analyseur de flux extracellulaire avec application future dans l’étude des dommages mitochondries effets indésirables connexes.