Roman besleyici-Alerjik sistemi fare doğal katil hücreler Vitro seri üretim için
Summary
Burada, mekanik çalışma içinde in vitro ve in vivoiçin bir besleyici-Alerjik farklılaşma sistemi kullanılarak gen susturmak fare NK hücreleri toplu üretim için bir protokol mevcut.
Abstract
Doğal öldürücü (NK) hücreleri doğuştan gelen bağışıklık sistemine ait olan ve ilk satır anti-kanser bağışıklık savunma; Ancak, tümör microenvironment görüntülenmez ve altta yatan mekanizma hala büyük ölçüde bilinmiyor. NK hücre tutarlı ve güvenilir bir kaynak eksikliği NK hücre dokunulmazlık araştırma ilerlemesini sınırlar. Burada, yüksek kalite ve kemik iliği türevi fare NK hücreleri besleyici-Alerjik bir koşulda miktarı sağlayabilir bir vitro sistem raporu. Daha da önemlisi, biz da siRNA aracılı gen susturmak başarıyla E4bp4 bağımlı NK hücre olgunlaşma bu sistemi kullanarak engeller olduğunu göstermektedir. Böylece, sistem ayırt bu roman vitro NK hücre dokunulmazlık araştırma için bir biomaterial çözümdür.
Introduction
Kanser ilerleme dahil olmak üzere ana bilgisayar kaynaklı immunocytes, örneğin, NK hücreleri tümör microenvironment1,2‘ de, büyük ölçüde bağlıdır. Çeşitli çalışmalar intratumoral NK hücreleri ile tümör ilerleme3,4olumsuz correlated gösterdi. Buna ek olarak, klinik çalışmalar NK hücre evlat edinen tedavisi kanser5,6,7,8,9için olası bir strateji olduğunu gösterdi. NK hücre tabanlı kanserli hastalarda son zamanlarda solid tümör için bir tedavi seçeneği olarak önerildi ama immünsüpresif sitokinler salgılanmasını ve downregülasyon ligandlar solid tümör microenvironment içinde etkinleştirme nedeniyle sorunlar yok 10,11. Dönüştürme büyüme faktörü-β (TGF-β) karsinojenezis içinde baskılayıcı bir rol oynamaya önermek, ama garip bir şekilde kanser hücrelerinin da tümör gelişimi12,13,14 desteklemek için TGF-β1 üretmek , 15. TGF-β sinyal NK hücreleri aşağı düzenleyen interferon responsiveness ve CD16 aracılı interferon-gamma (IFN-γ) üretim vitro16,17, via cytolytic faaliyet bastırmak 18.
TGF-β tümör microenvironment sinyal kesintileri kanserleri ortadan kaldırmak için olası bir yol olabilir, ancak tamamen TGF-β sinyal engelleme anti-inflamatuar fonksiyonu, nedeniyle otoimmün hastalıklar gelişimi tarafından kanıtlanan neden olur olumsuz yan etkileri sistemik inflamasyon da dahil olmak üzere, kardiyovasküler kusur ve otoimmünite Mouse modelleri19. Böylece, TGF-β-aracılı immünosupresyon çalışma mekanizması anlama kanser tedavisi için erişilebilir bir terapötik hedef tanımlaması sağlayacaktır.
NK hücre gelişimi için gerekli moleküler olayları aydınlatmak için fare kemik iliği hematopoetik kök hücreler NK içine ayırt20hücreleri için Williams ve ark. bir vitro sistemi kurdu. Bu sistem mekanik çalışma kimliği roman ataları NK hücreleri21de dahil olmak üzere NK hücre gelişimi büyük ölçüde kolaylaştırır. Ancak, kemik iliği ataları OP9 stromal hücreler bir besleyici katman20,21destekleyici sistemdeki kültürlü ve bu türdeş olmayan hücre nüfus büyük ölçüde gen engellemeden, daha fazla uygulama sınırları araçları (örneğin, gen siRNA aracılı susturmak) ayırt NK hücreleri için özel olarak uygulanan.
Burada, daha fazla Williams ve ark20in vitro sistemi değiştirerek geliştirilmiştir besleyici-free sistemi açıklanmaktadır. Sistemimizde, OP9 stromal besleyici hücreler gerekli değildir, ve bunun yerine Koşullu orta NK hücreleri vitrove bu farklılaşma son zamanlarda etkilemeden kullanılır OP9 bizi TGF-β kanser ilerlemesi yoluyla teşvik yapabiliyor ortaya çıkarmak için tümör microenvironment22E4bp4 bağımlı NK hücre gelişimi bastırmak. Bu yeni sistem başarıyla NK hücre gelişimi belirli koşullar altında moleküler mekanizması elucidating bir ücretsiz arka plan yöntem sağlar (örneğin, yüksek TGF-β1, gen siRNA aracılı susturmak, vs.) vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut çalışma, kemik iliği türevi fare NK hücreleri içinde vitroüretimi için yeni bir yöntem anlatmıştık. Özgün sistem21,22 cep besleyiciye başarıyla büyük ölçüde daha farklılaşma sistem istikrarlı OP9 hücreleri koşullu medyum tarafından değiştirilir. Buna ek olarak, sistem yüksek miktar üretebilir ve olgun NK saflığı vitro hem de in vivo hücre deneyleri, mekanik çalışma gibi insan hastalıkları …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışmada araştırma hibe Konseyi, Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) ve yenilik ve Hong Kong Teknoloji Fonu (Its/227/15, Its INP/164/16 Its-INP/242/16), doğrudan hibe tarafından araştırma-CUHK (2016.035) ve Hong Kong bilim adamı desteklenmiştir Program.
H.-yl tasarlanmış ve tüm deneylerin denetimli ve el yazması hazırlanması için katkıda bulunmuştur. Saatleri arasında-K.T. gerçekleştirilen deneyler, veri analiz ve el yazması hazırlanması için katkıda bulunmuştur. PC-T. T., J.Y.-F.C., js-C., H., s.-M.W., ve G.-yl hayvan numuneleri ve hayvan deneylerinde katıldı. Js, X.-R.H., ve K.-F.T. el yazması hazırlanması için katkıda bulunmuştur.
Materials
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
- Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
- Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
- Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
- Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
- Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
- Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
- Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
- Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
- Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
- Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
- Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
- Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
- Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
- Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
- Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
- Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
- Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
- Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
- Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
- Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).
