Un nuovo sistema privo di alimentatore per la produzione di massa di cellule di assassino naturali murini In Vitro
Summary
Qui, presentiamo un protocollo per produrre cellule NK murine silenziamento genico utilizzando un sistema di differenziazione privo di alimentatore per studi meccanicistici in vitro e in vivo.
Abstract
Cellule natural killer (NK) appartengono al sistema immunitario innato e sono una difesa immune prima linea anti-cancro; Tuttavia, essi vengono soppressi nel microambiente tumorale e il meccanismo di fondo è ancora in gran parte sconosciuto. La mancanza di una fonte affidabile e coerenza delle cellule di NK limita i progressi della ricerca di immunità delle cellule NK. Qui, segnaliamo un sistema in vitro che in grado di fornire alta qualità e quantità derivate da midollo osseo murine delle cellule di NK in una condizione senza alimentatore. Ancora più importante, inoltre dimostriamo che con successo silenziamento genico mediato da siRNA inibisce la maturazione delle cellule NK E4bp4-dipendente utilizzando questo sistema. Così, questa romanzo in vitro cellule NK differenziazione del sistema sono una soluzione di biomateriale per ricerca di immunità.
Introduction
Progressione del cancro dipende in larga misura il tumore microambiente1,2, tra cui immunociti host-derivato, ad esempio, le cellule NK. Numerosi studi hanno dimostrato che le cellule NK intratumoral sono correlate negativamente con la progressione del tumore3,4. Inoltre, studi clinici hanno mostrato che la terapia adottiva delle cellule NK è una possibile strategia per cancro5,6,7,8,9. L’immunoterapia del cancro basati su cellule NK recentemente è stato suggerito come opzione terapeutica per i tumori solidi, ma sfide esistano dovuto la secrezione di citochine immunosoppressive e downregulation di attivazione ligandi nel microambiente dei tumori solidi 10,11. Trasformando il fattore di crescita-β (TGF-β) è stato suggerito per svolgere un ruolo soppressivo nella carcinogenesi, ma paradossalmente le cellule tumorali producono anche TGF-β1 per supportare il tumore sviluppo12,13,14 , 15. segnalazione di TGF-β può sopprimere l’attività citolitica delle cellule di NK via giù-regolando la velocità di risposta dell’interferone e CD16-mediata di interferone-gamma (IFN-γ) produzione in vitro16,17, 18.
Anche se la rottura di segnalazione di TGF-β nel microambiente tumorale possa essere un modo possibile per l’eliminazione dei tumori, bloccando completamente segnalazione di TGF-β causerà malattie autoimmuni grazie alla sua funzione di anti-infiammatori, come testimoniano lo sviluppo della effetti collaterali tra cui l’infiammazione sistemica, difetti cardiovascolari e autoimmunità nel topo modelle19. Così, la comprensione del meccanismo di funzionamento di TGF-β-mediata immunosoppressione porteranno all’identificazione di un accessibile obiettivo terapeutico per il trattamento del cancro.
Per delucidare gli eventi molecolari necessari per lo sviluppo delle cellule NK, Williams et al. stabilite un sistema in vitro per la differenziazione di cellule staminali emopoietiche del midollo osseo murino in NK cells20. Questo sistema facilita in gran parte lo studio meccanicistico di sviluppo delle cellule NK, compresa l’individuazione di nuovi progenitori delle cellule NK21. Tuttavia, i progenitori di midollo osseo dovrebbero essere coltivati nel sistema con il supporto di cellule stromali OP9 come un alimentatore strato20,21, e questa popolazione cellulare eterogenea limita in gran parte l’applicazione ulteriore gene di interruzione strumenti (ad es., silenziamento genico mediato da siRNA) specificamente applicata per la differenziazione delle cellule NK.
Qui, descriviamo un sistema privo di alimentatore che è stato sviluppato modificando ulteriormente il sistema in vitro di Williams et al.20. Nel nostro sistema, le cellule stromal alimentatore OP9 non sono necessari, e invece OP9 medium condizionale è usato senza influenzare la differenziazione delle cellule NK in vitroe questo recentemente ci portano a scoprire che il TGF-β è in grado di promuovere la progressione del cancro tramite sopprimere lo sviluppo delle cellule NK E4bp4-dipendente nel microambiente tumorale22. Questo nuovo sistema fornisce con successo un metodo privo di sfondo per delucidare il meccanismo molecolare di sviluppo delle cellule NK in condizioni specifiche (ad es., alta TGF-β1, silenziamento genico mediato da siRNA, ecc.) in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nel presente lavoro, abbiamo descritto un metodo novello per la produzione di cellule NK murina derivanti dal midollo osseo in vitro. L’alimentatore delle cellule nel sistema originale21,22 è sostituito con successo dal medium condizionato delle cellule OP9, che in gran parte aumentata la stabilità del sistema di differenziazione. Inoltre, il sistema può produrre elevate quantità e purezza di NK maturo cellule per in vitro come pure in v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto dal Research Grants Consiglio di Hong Kong (GRF 468513, CUHK3/CRF/12R) l’innovazione e fondo della tecnologia di Hong Kong (15/227/ITS, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), sovvenzione diretta per ricerca-CUHK (2016.035) e studioso di Hong Kong Programma.
H.-Y.L. progettato e supervisionato tutti gli esperimenti e contribuito alla preparazione del manoscritto. P.M.-K.T. eseguirono degli esperimenti, hanno analizzato i dati e ha contribuito alla preparazione del manoscritto. P.C.-T. T., J.Y.-F.C., J.S.-C., H., d.-M.W., e G.-Y.L. raccolti campioni animali e partecipato negli esperimenti sugli animali. J.S., X.-R.H., e K.-F.T. contribuito alla preparazione del manoscritto.
Materials
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
- Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
- Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
- Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
- Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
- Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
- Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
- Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
- Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
- Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
- Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
- Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
- Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
- Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
- Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
- Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
- Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
- Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
- Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
- Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
- Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).
