הרומן מזין ללא מערכת לייצור המוני של תאים רוצח טבעי מאתר במבחנה
Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול בייצור המוני של ג’ין להחרשת תאי NK מאתר באמצעות מערכת בידול נטולת מזין עבור המחקר מכניסטית חוץ גופית בתוך ו ויוו.
Abstract
תאים (NK) רוצח טבעי שייכת מערכת החיסון המולדת, השורה הראשונה נגד סרטן מערכת החיסון הגנה; עם זאת, הם מדוכאים ב microenvironment הגידול, המנגנון הבסיסי הוא עדיין אינו מודע לקיומם. העדר מקור עקבית ומהימנה של תאי NK מגביל את התקדמות המחקר של חסינות התא NK. כאן, אנחנו מדווחים במבחנה מערכת שיכול לספק איכות גבוהה, כמות הנגזרות מח עצם של תאי NK מאתר בתנאי נטולת מזין. יותר חשוב, אנחנו גם להוכיח כי בתיווך siRNA ג’ין להחרשת בהצלחה מעכב ההבשלה התא NK תלויי-E4bp4 באמצעות מערכת זו. לפיכך, הרומן במבחנה NK תא זה המבדילים המערכת היא פתרון biomaterial למחקר חסינות.
Introduction
התקדמות סרטן תלוי במידה רבה הגידול microenvironment1,2, כולל המארח, נגזר immunocytes, למשל, תאי NK. מספר מחקרים הראו כי תאי NK intratumoral נמצאים בקורלציה שלילית עם3,התקדמות הגידול4. בנוסף, מחקרים קליניים הראו כי טיפול המאמצת בתאי NK היא אסטרטגיה אפשרית עבור סרטן5,6,–7,–8,–9. חיסוני סרטן המבוסס על תאי NK לאחרונה הוצע כאופציה טיפולית עבור גידולים מוצקים, אך אתגרים קיים בשל ההפרשה של ציטוקינים לדיכוי המערכת החיסונית ואת downregulation של הפעלת ליגנדים ב- microenvironment של גידולים מוצקים 10,11. שינוי צורה של גורם גדילה-β (TGF-β) הוצע כדי לשחק תפקיד מדכאים carcinogenesis, אבל באופן פרדוקסלי תאים סרטניים גם לייצר TGF-β1 כדי לתמוך את הגידול פיתוח12,13,14 , 15. TGF-β איתות יכול לדכא את פעילות תאי NK באמצעות ויסות מטה תגובתיות אינטרפרון, בתיווך CD16 אינטרפרון-גמא (IFN-γ) ייצור במבחנה16,17, cytolytic 18.
למרות שיבוש TGF-β איתות ב microenvironment הגידול עשוי להיות דרך אפשרית עבור ביטול סרטן, חוסמת לחלוטין TGF-β איתות יגרום מחלות אוטואימוניות בשל תפקידה אנטי דלקתיות, כפי שמעידים על התפתחות תופעות לוואי כולל דלקת מערכתית, מומי לב וכלי דם, מחלת חיסון עצמי עכבר מודלים19. לפיכך, הבנת מנגנון העבודה של TGF-β-מתווכת החיסוני תוביל אל זיהוי מטרה טיפולית נגישים לטיפול בסרטן.
התירי את האירועים המולקולריים הדרושים להתפתחות תאי NK, וויליאמס. ואח הקימה מערכת במבחנה כי להבדיל מאתר מח עצם תאי גזע hematopoietic לתוך NK תאים20. מערכת זו מקלה במידה רבה בחקר התפתחות התא NK, כולל זיהוי אבות הרומן של תאי NK21מכניסטית. עם זאת, צריך להיות תרבותי המוצא לאגס מח עצם במערכת עם תמיכה OP9 סטרומה תאים כמו מזין שכבה20,21, ומגביל אוכלוסייה הטרוגנית תא זו במידה רבה יישום נוסף של שיבוש גנטי כלים (למשל, בתיווך siRNA ג’ין להחרשת) שימושית במיוחד לתאי NK המבדילים.
כאן נתאר מערכת נטולת מזין, שפותחו על-ידי המערכת במבחנה של וויליאמס ואח20שינוי נוסף. במערכת שלנו, תאי סטרומה מזין OP9 אינם נדרשים, ולהוביל במקום OP9 המדיום המותנה משמש מבלי להשפיע על הבידול של NK תאים במבחנה, ואת זה לאחרונה לנו לחשוף כי TGF-β הוא לקדם התקדמות סרטן באמצעות פיתוח המדכאים של התא NK תלויי-E4bp4 microenvironment גידול22. מערכת חדשנית זו מספקת בהצלחה שיטה ללא רקע שחקרתי את המנגנון המולקולרי התפתחות תאי NK תחת תנאים מסוימים (למשל, גבוהה TGF-β1, בתיווך siRNA ג’ין להחרשת, וכו.) במבחנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בשנת העבודה הנוכחית, תארנו שיטה להפקת הנגזרות מח עצם מאתר NK תאים בתוך חוץ גופית. התא המזין21,המערכת המקורית22 מוחלף בהצלחה על-ידי המדיום המותנה של תאים OP9, שהגדילה במידה רבה את היציבות של המערכת בידול. בנוסף, המערכת יכולה לייצר כמות גבוהה, טוהר NK בוגרת תאי <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מחקר מלגות המועצה של הונג קונג (GRF 468513, CUHK3/crf לניסויים קליניים/12R) ואת החדשנות, קרן הטכנולוגיה של הונג קונג (ITS/227/15, ITS InP/164/16, ITS-InP/242/16), גרנט ישירה מחקר-CUHK (2016.035), מלומד הונג קונג תוכנית.
ה-י. ל תוכנן כל ניסויים מבוקרים, תרמה הכנת כתב היד. אחה צ-K.T. ביצע ניסויים, ניתחו נתונים, תרמה הכנת כתב היד. פי. סי-טי טי, J.Y.-יונייטד, י. ס-ג, ה, ש- M.W., ג-י. ל אספו דגימות בעלי חיים, השתתף בניסויים על בעלי חיים. י. ס, ר. י-ה, ק. ס. ז תרם הכנת כתב היד.
Materials
| OP9 cell line | ATCC | ATCC® CRL-2749™ | |
| MEM α, no nucleosides | Gibco | 22561021 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10500064 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Recombinant Murine IL-7 | PEPROTECH | 217-17 | |
| Recombinant Murine SCF | PEPROTECH | 250-03 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | PEPROTECH | 250-31L | |
| Recombinant Murine IL-2 | PEPROTECH | 212-12 | |
| Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent | Invitrogen | 1377815 | |
| IC Fixation Buffer | eBioscience | 00-8222-49 | |
| Flow Cytometry Staining Buffer | eBioscience | 00-4222-26 | |
| PE-conjugated anti-mouse CD244 | eBioscience | 12-2441-83 | |
| Cy3-conjugated anti-mouse NKp46 | Bioss | bs-2417R-cy3 | |
| Nonsense control (NC) | Ribobio | siN05815122147 | |
| siRNA against mouse E4BP4 mRNA | Ribobio | N/A | 5′-GAUGAGGGUGUA GUGGGCAAGUCUU-3′ |
References
- Schreiber, R. D., Old, L. J., Smyth, M. J. Cancer immunoediting: integrating immunity’s roles in cancer suppression and promotion. Science. 331 (6024), 1565-1570 (2011).
- Junttila, M. R., de Sauvage, F. J. Influence of tumour micro-environment heterogeneity on therapeutic response. Nature. 501 (7467), 346-354 (2013).
- Rusakiewicz, S., et al. Immune infiltrates are prognostic factors in localized gastrointestinal stromal tumors. Cancer Res. 73 (12), 3499-3510 (2013).
- Mamessier, E., et al. Human breast cancer cells enhance self tolerance by promoting evasion from NK cell antitumor immunity. J Clin Invest. 121 (9), 3609-3622 (2011).
- Stern, M., et al. Pre-emptive immunotherapy with purified natural killer cells after haploidentical SCT: a prospective phase II study in two centers. Bone Marrow Transplant. 48 (3), 433-438 (2013).
- Miller, J. S., et al. Successful adoptive transfer and in vivo expansion of human haploidentical NK cells in patients with cancer. Blood. 105 (8), 3051-3057 (2005).
- Rubnitz, J. E., et al. NKAML: a pilot study to determine the safety and feasibility of haploidentical natural killer cell transplantation in childhood acute myeloid leukemia. J Clin Oncol. 28 (6), 955-959 (2010).
- Curti, A., et al. Successful transfer of alloreactive haploidentical KIR ligand-mismatched natural killer cells after infusion in elderly high risk acute myeloid leukemia patients. Blood. 118 (12), 3273-3279 (2011).
- Bachanova, V., et al. Clearance of acute myeloid leukemia by haploidentical natural killer cells is improved using IL-2 diphtheria toxin fusion protein. Blood. 123 (25), 3855-3863 (2014).
- Stringaris, K., et al. Leukemia-induced phenotypic and functional defects in natural killer cells predict failure to achieve remission in acute myeloid leukemia. Haematologica. 99 (5), 836-847 (2014).
- Rouce, R. H., et al. The TGF-β/SMAD pathway is an important mechanism for NK cell immune evasion in childhood B-acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. 30 (4), 800-811 (2016).
- Derynck, R., Akhurst, R. J., Balmain, A. TGF-β signaling in tumor suppression and cancer progression. Nature Genet. 29 (2), 117-129 (2001).
- Massague, J. TGFbeta in cancer. Cell. 134 (2), 215-230 (2008).
- Ikushima, H., Miyazono, K. TGFbeta signalling: a complex web in cancer progression. Nat Rev Cancer. 10 (6), 415-424 (2010).
- Pickup, M., Novitskiy, S., Moses, H. L. The roles of TGFβ in the tumour microenvironment. Nat Rev Cancer. 13 (11), 788-799 (2013).
- Rook, A. H., et al. Effects of transforming growth factor beta on the functions of natural killer cells: depressed cytolytic activity and blunting of interferon responsiveness. J Immunol. 136 (10), 3916-3920 (1986).
- Bellone, G., Aste-Amezaga, M., Trinchieri, G., Rodeck, U. Regulation of NK cell functions by TGF-beta 1. J Immunol. 155 (3), 1066-1073 (1995).
- Trotta, R., et al. TGF-β utilizes SMAD3 to inhibit CD16-mediated IFN-γ production and antibody-dependent cellular cytotoxicity in human NK cells. J Immunol. 181 (6), 3784-3792 (2008).
- Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-β1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
- Chen, T. J., Kotecha, N. Cytobank: providing an analytics platform for community cytometry data analysis and collaboration. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 127-157 (2014).
- Williams, N. S., et al. Differentiation of NK1.1+, Ly49+ NK cells from flt3+ multipotent marrow progenitor cells. J Immunol. 163 (5), 2648-2656 (1999).
- Fathman, J. W., et al. Identification of the earliest natural killer cell-committed progenitor in murine bone marrow. Blood. 118 (20), 5439-5447 (2011).
- Tang, P. M., et al. Smad3 promotes cancer progression by inhibiting E4BP4-mediated NK cell development. Nat Commun. 6 (8), 14677 (2017).
