Disección y la coloración de los ovarios Pupal de Drosophila
Summary
El ovario del Drosophila es un sistema modelo excelente para estudiar el desarrollo del nicho de células madre. Aunque se han publicado métodos para disecar larvarios y adultos de los ovarios, disecciones de ovario pupa requieren técnicas diferentes que no han sido publicadas en detalle. Aquí describiremos un protocolo de disección, tinción y montaje pupas ovarios.
Abstract
A diferencia de ovarios de Drosophila adultos, pupas ovarios son relativamente difíciles de acceder y examinar debido a su pequeño tamaño, transparencia y encerrar dentro de una envoltura pupal. El reto de disección de ovarios pupas también radica en su ubicación física dentro de la pupa: los ovarios están rodeados por las células del cuerpo de la grasa dentro del abdomen pupal, y estas células de grasa debe ser removidas para permitir para la tinción de anticuerpos adecuada. Para superar estos desafíos, este protocolo utiliza pipetas de Pasteur modificado para requisitos particulares para extraer las células de la grasa corporal del abdomen pupal. Por otra parte, un cubreobjetos cámara se utiliza en lugar de un tubo de microcentrífuga durante el proceso de tinción para mejorar la visibilidad de las pupas. Sin embargo, a pesar de estas y otras ventajas de las herramientas utilizadas en el presente Protocolo, ejecución acertada de estas técnicas todavía puede implicar varios días de práctica debido al pequeño tamaño de los ovarios de la pupas. Las técnicas descritas en este protocolo se podrían aplicar a los experimentos de curso de tiempo en el que los ovarios se analizan en diversas etapas de desarrollo pupal.
Introduction
Investigación de células madre usando Drosophila ovarios ha expandido ampliamente desde la primera documentación de la célula de vástago hueco1,2,3,4. Tras el desarrollo de herramientas genéticas del seguimiento del linaje, ovario del Drosophila disecciones se han utilizado comúnmente para el estudio de linajes de células madre y señalización vías que regulan el mantenimiento de células madre, proliferación y suerte en el nicho de células madre. Conocimiento de estas vías de señalización puede dar ideas sobre posibles causas de los cánceres que se originan en la célula de vástago aberrante actividad5,6,7. Recientemente se ha demostrado que células madre somáticas en el ovario del Drosophila , conocidas como células de vástago del folículo (Eve), fuertemente se asemejan a mamífero las células intestinales de la madre en muchos aspectos de su organización8. Por esta razón, los ovarios de la Drosophila son un sistema modelo muy útil para estudiar el comportamiento de la célula de vástago.
Mientras que los ovarios de larvarios y adultos ofrecen pistas al desarrollo temprano de la célula de vástago y organización de la célula de vástago final en el nicho, respectivamente, el ovario pupa es una estructura intermedia en la que las células somáticas y germinales reorganizar y establecer sus identidades 9 , 10. aunque varios estudios han examinado aspectos del desarrollo de tejido en el ovario pupa10,11,12,13, echara la diferenciación y organización espacial tipos de células ovario durante el desarrollo pupal. En particular, durante este período ocurre la especificación de Eve. Este protocolo describe un método para la disección y la coloración ovarios pupas en puntos del tiempo deseado, una técnica que puede utilizarse en experimentos del curso del tiempo que analizan el desarrollo pupal ovario en detalle de las larvas a la etapa adulta.
Para tener en cuenta la inaccesibilidad del ovario dentro del abdomen pupa pupa, tamaño pequeño y transparencia, este protocolo utiliza herramientas tales como una pipeta de Pasteur de punta fina a medida para remover el tejido abdominal grasa corporal obstaculizar el acceso del anticuerpo a la ovarios. Un cubreobjetos claro, cámara utilizado durante el anticuerpo coloración ofrece una mayor visibilidad de las pupas y una plataforma más para mecer los ovarios en una “Nutator.” Basado en un protocolo para disecciones de ovario larvas de Maimon y Gilboa14, una concentración relativamente alta de Triton X-100 se ha empleado en los primeros pasos del procedimiento de tinción para maximizar el acceso permeabilización y el anticuerpo de membrana de la célula a la células ováricas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El paso más crítico y difícil de este protocolo consiste en la preparación de ovarios pupas antes de la fijación. Para asegurarse de que los ovarios, pequeño y enterrados por las células de grasa corporal dentro de la pupa del abdomen, se tiñen suficientemente con los anticuerpos, es importante no sólo romper una abertura grande en el saco abdominal con pinzas, pero también extraer las células del cuerpo de grasa que obstruyen la ovarios de los anticuerpos. Ejecución exitosa de este paso requiere aplicación …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por los institutos nacionales de salud (to1 GM079351 a D.K.). Damos las gracias por sus consejos sobre disecciones de ovario pupa basados en su Protocolo original Dorothea Godt. También agradecemos a Amy Reilein por su ayuda y comentarios sobre el manuscrito.
Materials
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
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