Рассечение и пятнать дрозофилы куколки яичников
Summary
Дрозофилы яичника является система отличная модель для изучения развития ниши стволовых клеток. Хотя методы для рассечения личинок и взрослых яичники были опубликованы, куколки завязи Анатомирование требуют разных методов, которые не были опубликованы в деталях. Здесь мы приводим протокол для рассечения, окрашивание и монтаж куколки яичников.
Abstract
В отличие от взрослых дрозофилы яичников, куколки яичников являются довольно трудно получить доступ и изучения из-за их малого размера, прозрачность и обшивка внутри куколки дело. Задача рассекает куколки яичников также лежит в их физическое местоположение в пределах куколки: яичников окружены жира тела клетки внутри куколки живота, и эти жировые клетки должны быть удалены для надлежащего антитело пятная. Для преодоления этих проблем, этот протокол использует настроенные Пастер пипец извлечь жир тела клетки из куколки живота. Кроме того камерные coverglass используется вместо пробки microcentrifuge во время процесса окрашивания для улучшения видимости куколок. Однако несмотря на эти и другие преимущества инструменты, используемые в настоящем Протоколе, успешное выполнение этих методов по-прежнему может включать несколько дней практики из-за небольшого размера куколки яичников. Методы, изложенные в настоящем Протоколе может применяться к времени курс эксперименты, в которых анализируются яичников на различных стадиях развития куколки.
Introduction
Исследования стволовых клеток с использованием дрозофилы яичников широко расширилась с момента первого документации3,2,1,ниши стволовых клеток4. После разработки происхождение генетических средств трассировки, дрозофилы яичника, Анатомирование широко использовались для изучения линий стволовых клеток и сигнальные пути, которые регулируют содержание стволовых клеток, распространение и судьба в нише стволовых клеток. Знание этих сигнальных путей может дать понимание потенциальных причин рака, которые исходят из ошибочной стволовых клеток активности5,6,7. Кроме того, недавно было показано, что соматических стволовых клеток в яичниках дрозофилы , известный как фолликула стволовые клетки (FSCs), сильно напоминают кишечных стволовых клеток млекопитающих во многих аспектах их организации8. По этой причине яичники дрозофилы являются систему весьма полезной моделью для изучения поведения стволовых клеток.
Хотя личинок и взрослых яичников предлагают ключи для раннего развития стволовых клеток и организации окончательный стволовых клеток в нише, соответственно, куколки яичника является промежуточная структура, в которой микрофлорой и соматические клетки реорганизовать и установить их личность 9 , 10. Хотя ряд исследований рассматривали аспекты развития тканей в куколки завязи10,11,12,13, остаются вопросы относительно дифференциации и пространственной организации типов клеток яичников во время развития куколки. В частности спецификации FSCs происходит в этот период. Этот протокол описывает метод для рассечения и пятнать куколки яичников в нужное время точках — метод, который может использоваться в времени курс экспериментов, которые анализируют развития куколки завязи в деталях от личинки до стадии взрослого.
С учетом небольшого размера, прозрачность и недоступность куколки завязи внутри куколки живота, этот протокол использует инструменты, такие как заказ тонким наконечником Pasteur накапайте для удаления тканей брюшной жир тела, препятствуя антитела доступ к яичники. Ясно, камерные coverglass, используемый в ходе антитело пятная предлагает большую видимость куколок и мягче платформы для качания яичников на «Nutator». Основываясь на протокол для личинок завязи Анатомирование Маймон и Гильбоа14, относительно высокая концентрация X-100 Тритон был нанят на начальных этапах пятная процедуру максимально клеточной мембраны permeabilization и антитела доступ к яичников клетки.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее критический и сложный шаг этот протокол включает подготовку куколки яичников до фиксации. Чтобы гарантировать, что яичники, малые и похороненный жира тела клетки внутри куколки живота, являются достаточно витражи с антителами, важно не только сорвать большое отверстие в брюш?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано национальных институтов здравоохранения (RO1 GM079351 по д.к.). Мы благодарим Dorothea Godt за ее полезные советы по куколки завязи Анатомирование, на основе ее первоначального протокола. Мы также благодарим Эми Reilein за ее помощь и комментарии на рукопись.
Materials
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).
