חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה
Summary
השחלה דרוזופילה הוא מערכת דגם מעולה ללימוד פיתוח גומחת תאי גזע. על פי שיטות ניקוד השחלות זחל ומבוגרים פורסמו, השחלה הגולמי והניתוחים דורשות טכניקות שונות זה לא פורסמו בפירוט. כאן אנחנו חלוקה לרמות פרוטוקול לנתח, מכתים של הרכבה השחלות הגולמי.
Abstract
בניגוד למבוגרים דרוזופילה שחלות, השחלות הגולמי קשים יחסית לגשת ולבדוק עקב שלהם קטן בגודל, טבלתי ו בפסליו בתוך תיק הגולמי. האתגר של לנתח השחלות הגולמי טמון גם המיקום הפיזי שלהם בתוך הגולם: השחלות מוקפים תאי שומן הגוף בבטן הגולמי, ויש להסירו תאי שומן אלה כדי לאפשר נוגדן המתאים מכתים. כדי להתגבר על האתגרים הללו, פרוטוקול זה מנצל pipets פסטר מותאם אישית כדי לחלץ את תאי הגוף שומן מהבטן הגולמי. יתר על כן, coverglass chambered משמש במקום צינור microcentrifuge במהלך תהליך צביעת כדי לשפר את הראות של הגלמים. עם זאת, למרות אלה, יתרונות נוספים של הכלים המשמשים פרוטוקול זה, ביצוע מוצלח של טכניקות אלה עשוי עדיין לכלול מספר ימי תרגול בשל גודלו הקטן של השחלות הגולמי. השיטות המתוארות ב פרוטוקול זה יכול לחול על זמן הקורס ניסויים שבהם מנותחים השחלות בשלבים שונים של פיתוח הגולמי.
Introduction
מחקר תאי הגזע באמצעות דרוזופילה השחלות התרחב נרחב מאז התיעוד הראשון של תאי גזע נישה1,2,3,4. בעקבות הפיתוח של שושלת היוחסין מעקב גנטי כלים, השחלה דרוזופילה והניתוחים שימשו נפוץ לחקר תאי הגזע שושלות, איתות המסלולים המסדירים תאי גזע תחזוקה, התפשטות, גורל גומחת תאי גזע. הידע של איתות המסלולים האלה עשוי להניב תובנות סיבות פוטנציאליות של סרטן שמקורן בתאי גזע aberrant פעילות5,6,7. גם לאחרונה הוכח כי תאי גזע סומאטית בשחלה דרוזופילה , המכונה בתאי גזע זקיק (FSCs), חריפה דומים בתרבית של תאי גזע מעיים בהיבטים רבים של הארגון שלהם8. מסיבה זו, דרוזופילה שהשחלות מערכת מודל שימושי מאוד ללמוד התנהגות תאי גזע.
בעוד השחלות זחל, למבוגרים מציעים רמזים כדי התפתחות תאי גזע מוקדמת וארגון תאי גזע הסופי של הגומחה, בהתאמה, השחלה הגולמי הוא מבנה ביניים שבו germline ותאים סומטיים לארגן מחדש ולהקים את זהותם 9 , 10. על פי מספר מחקרים בחנו היבטים של התפתחות רקמת השחלה הגולמי10,11,12,13, שאלות נותרו לגבי בידול ו הארגון המרחבי של סוגי תאים השחלות במהלך הפיתוח הגולמי. בפרט, המפרט של FSCs מתרחשת בתקופה זו. פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, צביעת השחלות הגולמי בנקודות הזמן הרצוי — טכניקה יכול לשמש בניסויים כמובן זמן לנתח התפתחות שחלה הגולמי בפירוט הזחל מ לבמה למבוגרים.
לקחת בחשבון גודל קטן, טבלתי, הנגישות של השחלה הגולמי בתוך הבטן הגולמי, פרוטוקול זה מנצל כלים כגון מחוייט דק-היטה פסטר pipet כדי להסיר רקמות הגוף השמן בבטן חוסם גישה נוגדן השחלות. ברור, תאיים coverglass בשימוש במהלך הנוגדן מכתים הצעות הניראות של הגלמים, פלטפורמה עדינה נדנדה השחלות על “Nutator”. בהתבסס על פרוטוקול עבור השחלה זחל יחליט על ידי מימון, גלבוע14, ריכוז גבוה יחסית של טריטון X-100 ננקטה השלבים הראשונים של התהליך מכתימים כדי למקסם את קרום התא permeabilization נוגדנים גישה תאים בשחלות.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלב הקריטי ביותר וקשה של פרוטוקול זה כרוך הכנה הגולמי השחלות לפני קיבוע. כדי להבטיח השחלות, קטן והיא קבורה על-ידי תאי שומן הגוף בבטן הגולמי, מוכתמים מספיק נוגדנים, חשוב לא רק תקרע חור גדול בתוך השק בטן עם מלקחיים, אבל גם לחלץ תאי שומן הגוף ההגנתיים החוסמים השחלות של הנוגדנים. ביצוע מוצלח של …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מכוני הבריאות הלאומיים (RO1 GM079351 כדי D.K.). אנו מודים דורותיאה מפציר על לה עצות מועילות על השחלה הגולמי והניתוחים בהתבסס על הפרוטוקול המקורי שלה. אנו מודים גם איימי Reilein לה סיוע והערות על כתב היד.
Materials
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).
