تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر
Summary
والمبيض المورفولوجية نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا الجذعية المتخصصة التنمية. ولو تم نشر أساليب لتشريح المبايض اليرقات والكبار، تتطلب تشريح المبيض الخوادر التقنيات المختلفة التي لم تنشر بالتفصيل. هنا أننا مخطط بروتوكول لتشريح وتلطيخ، وتصاعد المبايض الخوادر.
Abstract
على عكس الكبار المورفولوجية المبايض، المبايض الخوادر صعبة نسبيا الوصول ودراسة سبب هذه الصغيرة الحجم، وترانسلوسينسي، وغلفت ضمن حالة الخوادر. ويكمن التحدي لتشريح المبايض الخوادر أيضا في موقعها الفعلي داخل الخادرة: المبيض محاطة بخلايا الجسم الدهون داخل البطن الخوادر، ويجب إزالة هذه الخلايا الدهنية للسماح لتلطيخ جسم سليم. للتغلب على هذه التحديات، يستخدم هذا البروتوكول بيبيتس باستور مخصصة لاستخراج خلايا الجسم الدهون من البطن الخوادر. وعلاوة على ذلك، يستخدم كوفيرجلاس غرف بدلاً من أنبوب ميكروسينتريفوجي أثناء عملية المصبوغة لتحسين الرؤية الخوادر. ومع ذلك، على الرغم من هذه المزايا الأخرى للأدوات المستخدمة في هذا البروتوكول، والتنفيذ الناجح لهذه التقنيات قد تنطوي على لا تزال عدة أيام من الممارسة نظراً لصغر حجم المبايض الخوادر. يمكن تطبيق التقنيات المبينة في هذا البروتوكول على تجارب دورة الوقت الذي يتم تحليل المبايض في مراحل مختلفة من التنمية الخوادر.
Introduction
بحوث الخلايا الجذعية باستخدام المبايض المورفولوجية وسعت على نطاق واسع منذ أول الوثائق المتعلقة بالخلايا الجذعية المتخصصة1،2،،من34. بعد وضع النسب تتبع الأدوات الوراثية، المبيض المورفولوجية تشريح استخدمت عادة لدراسة الأنساب الخلايا الجذعية، ويشير إلى الممرات التي تنظم صيانة الخلايا الجذعية، والانتشار، ومصير الخلايا الجذعية المتخصصة. قد تسفر عن المعرفة من هذه المسارات إشارات ثاقبة الأسباب المحتملة للسرطانات التي تنشأ من الخلايا الجذعية الشاذة النشاط5،،من67. لقد ثبت مؤخرا أن الخلايا الجذعية الجسدية في المبيض المورفولوجية ، المعروفة باسم الخلايا الجذعية جريب (التابعة)، بقوة تشبه الخلايا الجذعية المعوية الثدييات في جوانب كثيرة من تلك المنظمة8. لهذا السبب، المبايض المورفولوجية نظام نموذج مفيد للغاية لدراسة سلوك الخلايا الجذعية.
بينما المبايض اليرقات والكبار تقديم أدلة للإسراع بتطوير الخلايا الجذعية والمنظمة نهائياً من الخلايا الجذعية في المكانة، على التوالي، المبيض الخوادر هو هيكل وسيطة التي germline وخلايا جسدية إعادة تنظيم وتحديد هوياتهم 9 , 10-على الرغم من أن العديد من الدراسات قد درست جوانب التنمية أنسجة المبيض الخوادر10،11،،من1213، تبقى الأسئلة المتعلقة بالتمايز ومنظمة المكانية أنواع خلية المبيض أثناء تطوير الخوادر. على وجه الخصوص، مواصفات التابعة يحدث خلال هذه الفترة. هذا البروتوكول يحدد طريقة لتشريح وتلطيخ المبايض الخوادر في النقاط الزمنية المطلوبة – تقنية التي يمكن استخدامها في تجارب دورة الوقت أن تحليل التنمية المبيض الخوادر بالتفصيل من اليرقات إلى مرحلة الكبار.
يستخدم هذا البروتوكول لحساب حجم صغير وترانسلوسينسي، وصعوبة الوصول إلى المبيض الخوادر داخل البطن الخوادر، أدوات مثل مصنوعة خصيصا بيبيت باستور رقيقة-يميل إلى إزالة أنسجة الجسم الدهون البطن التي تعرقل وصول الأجسام المضادة المبيض. كوفيرجلاس واضحة، وغرف المستخدمة خلال جسم تلطيخ رؤية عروض أكبر في الخوادر ومنصة الطف لهزاز المبايض في “نوتاتور”. بناء على بروتوكول لتشريح المبيض اليرقات ميمون وجلبوا14، استخدمت في الخطوات الأولى للإجراء المصبوغة إلى أقصى حد ممكن الوصول غشاء الخلية بيرميبيليزيشن والأجسام المضادة لتركيزات عالية نسبيا من X-100 تريتون خلايا المبيض.
Protocol
Representative Results
Discussion
أن الخطوة الأكثر صعبة وحرجة من هذا البروتوكول ينطوي على إعداد الخوادر المبايض قبل التثبيت. للتأكد من أن المبايض، صغيرة ودفن بخلايا الجسم الدهون داخل البطن الخوادر، ملطخة بما فيه الكفاية مع الأجسام المضادة، من المهم أن الدموع ليس فقط فتحه كبيرة في كيس البطن بالملقط، ولكن أيضا استخراج خلاي…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان يؤيد هذا البحث “المعاهد الوطنية للصحة” (RO1 GM079351 إلى D.K.). ونشكر دوروثيا Godt على نصيحتها مفيدة في تشريح المبيض الخوادر استناداً إلى بلدها الأصلي للبروتوكول. ونشكر أيضا ريلين إيمي لها المساعدة والتعليقات على المخطوطة.
Materials
| Dumont #5 Forceps, biology | Fine Scientific Tools | 11252-20 | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass | Thermo Fisher Scientific | 155383 | |
| Dissection microscope | Nikon | SMZ-10A | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Analysis software | Carl Zeiss | Zen | |
| 9 Depression Glass Spot Plates | Pyrex | 7220-85 | |
| Pasteur pipet | Fisher Scientific | 13-678-6B | |
| Pasteur pipet bulb | Various vendors | ||
| Bunsen burner | Various vendors | ||
| Fisherfinest Premium Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 12-544-2 | |
| 22 x 22 mm glass coverslips No 1 | VWR | 48366-067 | |
| Dapi Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| Double-sided tape | Scotch | ||
| Nutator | Clay Adams | ||
| Fine brush #0, #3-#5 | Various vendors | ||
| Gilson Pipetman Starter Kit | Thomas Scientific | F167300 | Contains p20, p200, p1000 pipettors |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Dilute to 4% paraformaldehyde in 1x PBS |
| Triton | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
| 10x PBS | Ambion | AM9624 | Dilute to 1x PBS |
| Normal Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 5000121 | Dilute to 10% normal goat serum in PBST with 0.5% Triton concentration |
| Primary antibodies (in protocol: 7G10 anti-Fasciclin III diluted 1:250, rabbit anti-phosphohistone H3 diluted 1:1000) | Various vendors (in protocol: Developmental Studies Hybridoma Bank, Millipore) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Secondary antibodies (in protocol: Alexa-546, FITC-conjugated anti-rabbit serum) | Various vendors (in protocol: Molecular Probes, Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.) | Dilute in PBST with 0.5% Triton concentration | |
| Fly vials | Denville Scientific | V9406 | |
| Cotton Balls, For Wide Vials | Genesee Scientific | 51-102W | |
| Yeast, Bakers Dried Active | MP Biomedicals | 101400 | |
| Fly food | Produced in laboratory | Mixture of water, brewer's yeast, cornmeal, molasses, agar, EtOH, penicillin, methyl 4-hydrobenzoate, and propionic acid | |
| Male and female Drosophila flies (genotype used in protocol: yw; P[Fz3-RFP, w+]/TM2) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Losick, V., Morris, L., Fox, D., Spradling, A. Drosophila Stem Cell Niches: A Decade of Discovery Suggests a United View of Stem Cell Regulation. Dev Cell. 21 (1), 159-171 (2011).
- Kirilly, D., Xie, T. The Drosophila ovary: an active stem cell community. Cell Res. 17 (1), 15-25 (2007).
- Dansereau, D. A., Lasko, P. The Development of Germline Stem Cells in Drosophila. Method Mol Biol. 450, 3-26 (2008).
- Pearson, J., López-Onieva, L., Rojas-Ríos, P., Gonzáles-Reyes, A. Recent advances in Drosophila stem cell biology. Int J Dev Biol. 53, 1329-1339 (2009).
- Arwert, E. N., Hoste, E., Watt, F. M. Epithelial stem cells, wound healing and cancer. Nat Rev Cancer. 12 (3), 170-180 (2012).
- Barker, N., et al. Crypt stem cells as the cells-of-origin of intestinal cancer. Nature. 457 (7229), 608-611 (2009).
- Daley, G. Q. Chronic myeloid leukemia: proving ground for cancer stem cells. Cell. 119 (3), 314-316 (2004).
- Reilein, A., et al. Alternative direct stem cell derivatives defined by stem cell location and graded Wnt signaling. Nat Cell Biol. 19 (5), 433-444 (2017).
- Eliazer, S., Buszczack, M. Finding a niche: studies from the Drosophila ovary. Stem Cell Res Ther. 2 (6), 45 (2011).
- Godt, D., Laski, F. A. Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric à brac. Development. 121 (1), 173-187 (1995).
- King, R. C., Aggarwal, S. K., Aggarwal, U. The development of the female Drosophila reproductive system. J Morphol. 124 (2), 143-166 (1968).
- Vlachos, S., Jangam, S., Conder, R., Chou, M., Nystul, T., Harden, N. A Pak-regulated cell intercalation event leading to a novel radial cell polarity is involved in positioning of the follicle stem cell niche in the Drosophila ovary. Development. 142 (1), 82-91 (2015).
- Irizarry, J., Stathopoulos, A. FGF signaling supports Drosophila fertility by regulating development of ovarian muscle tissues. Dev Biol. 404 (1), 1-13 (2015).
- Maimon, I., Gilboa, L. Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries. J Vis Exp. (51), e2537 (2011).
- Kerkis, J. The Growth of the Gonads in DROSOPHILA MELANOGASTER. Genetics. 16 (3), 212-224 (1931).
- Yamanaka, N., et al. Neuroendocrine Control of Drosophila Larval Light Preference. Science. 341 (6150), 1113-1116 (2013).
- Bainbridge, S., Bownes, M. Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster. Development. 66, 57-80 (1981).
- Courdec, J., et al. The bric à brac locus consists of two paralagous genes encoding BTB/POZ domain proteins and acts as a homeotic and morphogenetic regulator of imaginal development in Drosophila. Development. 129, 2419-2433 (2002).
- Arrese, E. L., Soulages, J. L. INSECT FAT BODY: ENERGY, METABOLISM, AND REGULATION. Annu Rev Entomol. 55, 207-225 (2011).
- Zhang, Y., Xi, Y. Fat Body Development and its Function in Energy Storage and Nutrient Sensing in Drosophila melanogaster. J Tissue Sci Eng. 6 (1), (2014).
- Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila Ovaries. J Vis Exp. (1), e52 (2006).
