Un método mejorado para la recolección de líquido cefalorraquídeo de los ratones anestesiados
Summary
Este protocolo describe una técnica mejorada para la abundante colección de líquido cefalorraquídeo (LCR) sin contaminación de la sangre. Con la mayor colección de la muestra y la pureza, se pueden realizar análisis más uso de CSF para mejorar nuestra comprensión de las enfermedades que afectan el cerebro y la médula espinal.
Abstract
El líquido cerebroespinal (CFS) es un fluido corporal valioso para el análisis en la investigación de la neurociencia. Es uno de los fluidos en contacto más cercano con el sistema nervioso central y por lo tanto, se puede utilizar para analizar el estado enfermo del cerebro o la médula espinal sin acceder directamente a estos tejidos. Sin embargo, en los ratones es difícil de obtener de la cisterna magna debido a su proximidad a los vasos sanguíneos, que a menudo contaminan las muestras. El área de recolección de LCR en ratones también es difícil de diseccionar a y a menudo sólo pequeñas muestras se obtienen (máximo de 5-7 μl o menos). Este protocolo describe detalladamente una técnica que mejora en los métodos actuales de colección para minimizar la contaminación de la sangre y permiten la abundante colección de LCR (en promedio que 10-15 μl se pueden recoger). Esta técnica puede utilizarse con otros métodos de disección para la colección de tejidos de ratones, como no afecta ninguna tejidos durante la extracción de la CSF. Así, el cerebro y la médula espinal no se ven afectadas con esta técnica y permanecen intactos. Con pureza y una mayor recolección de muestra de LCR, análisis más pueden utilizarse con esta investigación de la neurociencia de líquido para más ayuda y entienden mejor las enfermedades que afectan el cerebro y la médula espinal.
Introduction
El LCR es un fluido corporal valioso para el análisis en la investigación de la neurociencia. El LCR se hace principalmente de plasma de sangre, que contiene pocas células (sin glóbulos rojos y sólo unas pocas células blancas de la sangre) y está casi libre de proteínas. Es uno de los fluidos en contacto con el sistema nervioso central (SNC) y puede pasar muchos electrolitos del cerebro y la médula espinal del sistema periférico. En los seres humanos, CSF muestras se pueden recoger para ayudar en el diagnóstico de la enfermedad o para fines de investigación en ensayos clínicos, como una punción raquídea (punción lumbar) es un procedimiento invasivo, menor: el líquido cefalorraquídeo puede reflejar los cambios en el SNC sin tener que acceder directamente a estos tejidos. Así, en los últimos años, para fines de investigación en la clínica, se han obtenido muestras de CSF de pacientes de enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer y otras demencias1,2,3. Hay muchos análisis de biomarcadores que se han desarrollado utilizando muestras de CSF para potencialmente ayudar en el diagnóstico de enfermedades en la clínica2,3. Sin embargo, hay mucho debate sobre la fiabilidad de estos ensayos para producir resultados consistentes y sensibles para diagnosticar específicamente la enfermedad4,5. Por lo tanto, hay una gran necesidad para el desarrollo de mejores ensayos y objetivos, que pueden encontrarse en el líquido cefalorraquídeo, para ayudar en la producción de una técnica estándar para diagnosticar enfermedades neurodegenerativas con mayor sensibilidad y especificidad. Debido a la importancia potencial de muestras humanas de la CSF en la enfermedad, la colección del LCR de los roedores en la investigación de la neurociencia es también de interés.
Ratones son animales importantes en la investigación biológica y médica y permiten la prueba de potenciales compuestos terapéuticos y estudios de prueba de concepto antes de ensayos clínicos en humanos. Sin embargo, en ratones es difícil obtener muestras CSF debido a su proximidad al cerebro en un animal pequeño, como el método de recolección de LCR en ratones es obtenerlo a través de la cisterna magna, una abertura entre el cerebelo y la superficie dorsal de la médula oblongada. Esto causa dificultad en la recolección de muestras de CSF como esta área es difícil de diseccionar a y en proximidad cercana a los vasos sanguíneos, aumentando el riesgo de contaminación de las células de la sangre. Debido a estas dificultades, la mayoría de los investigadores sólo puede obtener una pequeña cantidad de LCR para análisis (generalmente indicado como μl 5-7) y la contaminación de muestras de CSF en las células de la sangre es una preocupación primaria para análisis6,7,8 , 9. contaminación de la sangre puede ocultar resultados y no verdaderamente reflejan el estado del SNC. Además, muestra limitada recogida puede impacto investigación como en la cantidad habitual de ratones es suficiente sólo una medición (en duplicado o triplicado) usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA). Así, muestras CSF son agrupadas generalmente de varios ratones con el fin de tener suficiente muestra para ejecutar múltiples ensayos. Desarrollando un protocolo para la abundante, colección incontaminada de la CFS de ratones se desea grandemente y será beneficiosa en la mejora de la investigación de la neurociencia con roedores.
En el presente Protocolo, una técnica para la abundante (un promedio de 10-15 μl) colección de LCR de ratones anestesiados se describe en detalle y mejora en un método actualmente conocido de recolección de LCR para minimizar la contaminación de sangre10. Un protocolo robusto para recolección de LCR ayudará en el desarrollo de análisis de biomarcadores basados en la CSF, que podría utilizarse para ayudar en el diagnóstico de la enfermedad, así como mejorar la investigación en los mecanismos que subyacen a las enfermedades que afectan el SNC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe detalladamente una técnica que mejora las actuales métodos10 de recolección de LCR para minimizar la contaminación de la sangre y permitir la abundante colección de LCR (promedio ~ 10-15 μl pueden obtenerse) de ratones. Al romper la punta del capilar, la punta del tubo capilar no debe ser demasiado pequeña (como el LCR se extraerán muy lentamente) o demasiado grandes (no ser fina suficiente para recoger el LCR y tejido puede alojarse en el capilar). Debe tenerse cui…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación de Ciencias naturales nacionales de China (81650110527, 81371400) y nacional clave básica de investigación programa de China (2013CB530900).
Materials
| Chloral hydrate (used as anesthetic) | Sinopharm Chemicals Reagen Co. Ltd. | 30037517 | CAS number 302-17-0. |
| Dissecting scissors | 66 vision technology | 54002 | |
| Dissecting curved forceps | 66 vision technology | 53072 | |
| Dissecting straight forceps | 66 vision technology | 53070 | |
| Mouse adapter (with ear bars) | Made in-house. | N/A | Similar equipment available from World Precision Instruments. |
| Dissecting microscope | Meiji Labax | Model 15381 | |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301 | |
| Magnetic base for micromanipulator | Kanetec | MB-K | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100-4 | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-1000 | |
| Syringes (1ml) | Tansoole | 02024692 | For 1ml. |
| Microtubes (1.5ml) | Axygen | MCT-150-C | |
| Protease inhibitor Cocktail Set III EDTA-free | Calbiochem | 539134 | |
| Human Aβ42 ELISA kit | Invitrogen | KHB3441 | |
| Piping (teflon tubing) | World Precision Instruments | MMP-KIT | Obtained from a microinjection kit and attached to the capillary holder and syringe. |
| Mini centrifuge | Tiangen Biotech | OSE-MC8 | |
| Cotton buds | Obtained from any household store/pharmacy. | N/A |
References
- Anoop, A., Singh, P. K., Jacob, R. S., Maji, S. K. CSF Biomarkers for Alzheimer’s Disease Diagnosis. Int. J. Alzheimers. Dis. 2010, 1-12 (2010).
- Blennow, K., Hampel, H., Weiner, M., Zetterberg, H. Cerebrospinal fluid and plasma biomarkers in Alzheimer disease. Nat. Rev. Neurol. 6 (3), 131-144 (2010).
- Schoonenboom, N. S. M., et al. Cerebrospinal fluid markers for differential dementia diagnosis in a large memory clinic cohort. Neurology. 78 (1), 47-54 (2012).
- Molinuevo, J. L., et al. The clinical use of cerebrospinal fluid biomarker testing for Alzheimer’s disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer’s Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer’s Dement. 10 (6), 808-817 (2014).
- Fagan, A. M. CSF biomarkers of Alzheimer’s disease: impact on disease concept, diagnosis, and clinical trial design. Adv. Geriatr. 2014, 1-14 (2014).
- Ramautar, R., et al. Metabolic profiling of mouse cerebrospinal fluid by sheathless CE-MS. Anal. Bioanal. Chem. 404 (10), 2895-2900 (2012).
- Liu, L., Herukka, S., Minkeviciene, R., Vangreon, T., Tanila, H. Longitudinal observation on CSF Aβ42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol. Dis. 17 (3), 516-523 (2004).
- Schelle, J., et al. Prevention of tau increase in cerebrospinal fluid of APP transgenic mice suggests downstream effect of BACE1 inhibition. Alzheimer’s Dement. , (2016).
- You, J. -. S., Gelfanova, V., Knierman, M. D., Witzmann, F. A., Wang, M., Hale, J. E. The impact of blood contamination on the proteome of cerebrospinal fluid. Proteomics. 5 (1), 290-296 (2005).
- Liu, L., Duff, K. A Technique for Serial Collection of Cerebrospinal Fluid from the Cisterna Magna in Mouse. J. Vis. Exp. (21), (2008).
- Maia, L. F., et al. Changes in amyloid-β and Tau in the cerebrospinal fluid of transgenic mice overexpressing amyloid precursor protein. Sci. Transl. Med. 5 (194), 194re2 (2013).
- Oshio, K. Reduced cerebrospinal fluid production and intracranial pressure in mice lacking choroid plexus water channel Aquaporin-1. FASEB J. , (2004).
