Consecuencias conductuales y reproductivas a largo plazo de exposición embrionaria a dosis bajas sustancias tóxicas

Protocolos que se indican a continuación han sido estandarizados para probar los efectos de la exposición BPA durante la embriogénesis temprana y pueden ser modificados para su uso con BPS, BPF o interruptores endocrinos y tóxicos en C. elegans embriones. 1. material instalación Disolver 1,5 g de NaCl, 1.25 g de peptona y 8,5 g de agar en el agua a 500 mL para preparar 500 mL de medio de18 medios de crecimiento de nematodos (NGM). Después de la esterilización en autoclave (121 ° C, 15 PSI, 20 minutos), Añadir 0.5 mL de colesterol (5 mg/mL en etanol), 0,5 mL de 1 M MgSO4, 0,5 mL de 1 M de CaCl2 y 12,5 mL de tampón de fosfato de potasio de 1 M, pH 7,4 (108,3 g de KH2PO4 35,6 g de K2HPO4, agua 1 L). Preparar solución de hipoclorito al mezclar 25 mL de 1 KOH de N, 4 mL de lejía y 71 mL de agua. Hacen de esta solución fresca. Preparación de Buffer M9 mezclando 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 5 g de NaCl, 5 mL de 1 M de MgSO4y el agua a 1 L. Preparar el tampón S18 mezclando 129 mL de 0,02 M K2HPO4, 871 mL de KH2PO4y 5,85 g de NaCl. Esterilice en autoclave los buffers M9 y S. Cultivar una cultura noche de Escherichia coli (cepa 50 OP) en 20 mL de caldo Luria (LB). BPA se disuelven en etanol al 10% para hacer una solución stock de 1 mM. Hacer diluciones subsecuentes de 0.1 μm, 0,5 μm, 1 μm, 5 μm y 10 μm en tampón de S.Nota: Dilución en el búfer de S acuoso reduce la concentración de etanol; por ejemplo, en la mayor concentración de BPA que se describe en este protocolo (10 μm), la concentración de etanol es 0,1% v/v. 2. cultivo de C. elegans y sincronización Vierta los medios NGM en placas de 100 mm (aproximadamente 25 mL/placa) y deje que se solidifique. Una vez solidificado, semilla las placas separando 150 μL de e. coli OP50 del cultivo líquido crecido durante la noche. Incube las placas a 37 ° C durante la noche. Al día siguiente, traslado gusanos de N2 en las nuevas placas en trozos una losa aproximada de cuadrado de 1 cm. Permiten gusanos crecer durante 3 días a 20 ° C hasta que la placa está poblada con adultos maduros bien alimentados que contienen embriones visibles. Para sincronizar, lave cada placa mediante pipeteo hasta 5 mL de buffer M9 en la placa. Transferir el líquido a un tubo de centrífuga cónico de 15 mL estéril.Nota: La sincronización se realiza para matar a gusanos adultos y recoger embriones que son relativamente el mismo escenario. Centrifugar a 3.000 x g durante 4 min a temperatura ambiente para obtener un pellet suelto de gusanos adultos. Con una pipeta de 10 mL, retire con cuidado el sobrenadante para dejar intacta la pelotilla. Añadir 5 mL de la solución de hipoclorito y mezclar suavemente. Centrifugar a 3.000 x g a temperatura ambiente durante 4 minutos. Retirar el sobrenadante con una pipeta de 10 mL y lavar con 7 mL de buffer M9. Repita este paso dos veces. 3. exponer los gusanos a BPA Después del último lavado de paso 2.7 anterior, suspender cerca de 100 μl de huevos con buffer M9. Transferir aproximadamente 50 μl de los huevos a los tubos del microfuge 2 mL ya que contienen la concentración adecuada que BPA diluido en tampón de S. Ajustar la cantidad de S-buffer para asegurar la correcta concentración final de BPA (μm 0.0, 0.1 μm, 0,5 μm, 1.0 μm, 5.0 μm y 10 μm) por el tubo. Tabla 1 ilustra una forma de hacer las diluciones. Para la concentración de BPA Final Acción BPA (100 μM) S Buffer Gusanos de sincronizada 0,1 ΜM 1 ΜL 949 ΜL 50 ΜL 0,5 ΜM 5 ΜL 945 ΜL 50 ΜL 1 ΜM 10 ΜL 940 ΜL 50 ΜL 5 ΜM 50 ΜL 900 ΜL 50 ΜL 10 ΜM 100 ΜL 850 ΜL 50 ΜL Tabla 1: Acción BPA, S buffer y sincronizados gusanos utilizados para alcanzar las concentraciones deseadas utilizadas para nuestro estudio. Colocar tubos en una coctelera y agite suavemente durante 4 horas a 20° C, a 25 rpm para un agitador rotatorio o inclinaciones 25/min para un agitador oscilante. Después de 4 h, colocar tubos en los titulares de tubo y gusanos resolver. Deseche el sobrenadante y transferir gusanos a placas (NGM con OP50 e. coli). Hacer el cultivo líquido OP50 e. coli según lo indicado en 1.5 y las placas de la semilla como se indica en 2.1. Dejar las gusanos crecer durante 60 horas en 20 ° C. Examinar las placas de todos los días de contaminación. Contaminados planchas NGM son generalmente descoloridas y acompañados de colonias individuales. Ver gusanos bajo el microscopio para masificación. La falta de césped OP50 e. coli y gusanos concentrados en pequeñas manchas significa hacinamiento. 4. anterior toque habituación ensayo Transferir a aproximadamente 10 jóvenes sincronizados recoger gusanos adultos a nuevas placas NGM no sembradas usando un alambre de platino 30 G esterilizados por fuego. Deje reposar durante 5 minutos permitir que los gusanos de tiempo para aclimatarse a la nueva placa. La respuesta de habituación, utilice un pelo de ceja atado al extremo de un pincho de madera o palillo de dientes y esterilización por inmersión en etanol al 70%. Limpie con un paño limpio libre de pelusas y esperar 1 minuto para el etanol se evapore apagado. Toque suavemente el gusano en la cabeza (parte anterior del bulbo faríngeo) con el pelo de la ceja. Repita los toques, permitiendo 10 s entre toques para permitir que el gusano recuperar. Continuar al tacto (permitiendo intervalos interstimulus de 10 s) hasta que el gusano ya no se mueve hacia atrás. En este punto, el gusano ha habituado al estímulo. Anotar el número de toques para el gusano a habituarse. Analizar la diferencia entre las tasas medias de habituación de los controles tratados y no tratados con ANOVA unidireccional seguida de post-hoc de Tukey. 5. gusano fecundidad ensayo Traslado individual L3 gusanos a un plato fresco y semillas usando una selección platino. Asegúrese de que sólo un gusano esté colocada por placa.Nota: después de la etapa larval L3, gusanos se convierten en larvas L4 y la edad adulta. Recolección temprana es conveniente en que son lo suficientemente grandes como para el traslado de los individuos asegurando que han no ya pusieron los huevos que de lo contrario sería faltados en la cuenta. Contar el número de huevos puestos cada 12 – 24 h. Después de contar, transferir el gusano de los padres a una nueva placa. Repita hasta que el gusano deja de poner huevos, por lo general después de 5 días cuando se incubaron a 20 ° C.Nota: en promedio, un gusano de tipo salvaje puede poner hasta 300 huevos; por lo tanto, transferir al padre a una nueva placa diariamente evita el hacinamiento. Analizar la diferencia entre el número promedio de huevos puestos por los controles tratados y no tratados con ANOVA unidireccional seguida de post-hoc de Tukey.